Dot blotting
Dot blot är en teknik som används inom molekylärbiologi för att detektera olika makromolekyler som nukleinsyror eller proteiner. Denna teknik är en viss förenkling av Western blot : prover som innehåller de studerade makromolekylerna appliceras omedelbart på ett nitrocellulosa- eller PVDF-membran, och går förbi stadiet av preliminär elektrofores i PAAG (särskilt när man arbetar med proteiner).
Protokoll för att arbeta med PVDF-membran
- Applicera testproverna på det torra PVDF-membranet (1-3 µl lösning per punkt). När man arbetar med ett PVDF-membran måste bufferten i vilken proverna är lösta ha en tillräckligt hög jonstyrka , annars kanske lösningen helt enkelt inte kommer in i membranet på grund av dess hydrofoba egenskaper.
- Membranet måste torkas. Vanligtvis räcker det med 30 minuter i rumstemperatur.
- Placera membranet i buffert för att minska ospecifika antikroppsbindningar. Rollen för ett medel som minskar ospecifika interaktioner utförs vanligtvis av bovint serumalbumin (BSA) eller mjölkpulver . 20 minuter - 1 timme i rumstemperatur.
- Placera membranet i primär antikroppsbuffert. BSA eller mjölkpulver finns också i denna buffert, men i en mindre mängd. 1 timme - PÅ, T = 4 С°.
- Tvätta membranet 3 x 5 min.
- Placera membranet i en buffert som innehåller en sekundär antikropp som innehåller ett detektionsmedel som pepparrotsperoxidas . 1-2 timmar i rumstemperatur.
- Tvätta membranet igen i 3 x 5 min.
- Placera membranet i detektionslösningen. Det är bättre att tillsätta 30% väteperoxid till en kommersiell lösning (cirka 10-50 µl per 10 ml lösning). 1-3 minuter i rumstemperatur.
- Upptäckt. Vid användning av sekundära antikroppar med pepparrotsperoxidas observeras kemiluminescerande strålning orsakad av att substratet skärs av från detektionslösningen med pepparrotsperoxidas. Vid användning av en enhet som registrerar kemiluminescens är en mycket liten exponering (upp till 2 minuter) tillräcklig
Se även