Knockout mus

En knockoutmus  är en genetiskt modifierad laboratoriemus där en av generna avsiktligt slås ut genom deletion eller ersättning med en viss nukleotidsekvens . Med deras hjälp är det lätt att studera rollerna för sekvenserade gener vars funktioner ännu inte har fastställts. Genom att störa en viss gen och undersöka de resulterande skillnaderna från normalt beteende eller fysiologi, kan försöksledare försöka fastställa dess funktion.

Människans fysiologi liknar den hos möss, och forskare kan använda dessa djur för att testa medicinsk teknik relaterade till mänsklig fysiologi, eftersom användningen av mänskliga embryon inte accepteras av forskarsamhället av etiska skäl. Därför är möss för närvarande den mest lämpliga försöksdjursarten för vilken knockoutmetoden lätt kan tillämpas. Den första knockout-musen skapades av Mario R. Capecchi , Martin Evans och Oliver Smithies 1989, för vilken de tilldelades 2007 års Nobelpris i fysiologi eller medicin . Aspekter av knockout-musteknologin och själva mössen har patenterats i många länder av privata företag. Genknockout hos laboratorieråttor är mycket svårare och har blivit möjlig först sedan 2003 [1] [2] .

Användning

Att stänga av aktiviteten hos en gen ger värdefulla ledtrådar till hur den fungerar. På grund av likheten mellan mänskliga gener och musgener ger observation av egenskaperna hos knockoutmöss data för forskare. Med hjälp av informationen drar forskare slutsatser om en gens roll i utvecklingen av en organism [3] , i synnerhet om förmågan att svara på sjukdomar hos människor.

Exempel på forskning där knockoutmöss har varit användbara är att studera och modellera olika typer av cancer, fetma, hjärtsjukdomar, diabetes, artrit, missbruk, ångest, åldrande och Parkinsons sjukdom . Knockoutmöss erbjuder också ett biologiskt sammanhang där läkemedel och andra terapier kan utvecklas och testas.

Procedur

"För att erhålla knockoutmöss introduceras den resulterande genetiskt modifierade konstruktionen i embryonala stamceller, där konstruktionen genomgår somatisk rekombination och ersätter den normala genen, och de modifierade cellerna implanteras i förädlingen av nya sorter genom klassiskt urval är nästan omöjligt, därför För närvarande ställs de största förhoppningarna på genteknik. Gen knockout kan användas för att studera funktionen hos en viss gen. Detta är namnet på tekniken att radera en eller flera gener, vilket gör att man kan studera konsekvenserna av en sådan mutation. För knockout syntetiseras samma gen eller dess surrogatmammas blastocyst" [4] .

Avelsschema för att få knockoutmöss. Skapandet av möss börjar i ögonblicket för att skapa cellkulturer, vilket introducerar den önskade organismen som skapas i ett ungt embryo. Med användning av lambda-fag eller kosmid extraheras målgenen från musens genomiska bibliotek genom in vivo-metoden. En dominant selekterbar markör infogas istället, medan målgenen tas bort samtidigt . "Som ett resultat erhålls en (molekylärbiologi) | hybridplasmid , i vilken segment av målmusgenen (flankerande sekvenser) är fästa vid den valbara markören till höger och vänster. Celler med en inaktiverad gen infogas i blastocyter. Embryonala stamceller isoleras från musblastocysten (mycket ungt embryo) och odlas in vitro. För det här exemplet tar vi vita musstamceller. Blastocyster som innehåller celler som är både vilda och knockoutceller injiceras i adoptivmoderns livmoder Detta resulterar i att avkomma eller vildtyp, färgade i samma färg som en blastocystdonator (grå) eller en chimär (blandad) och delvis utslagna Chimera möss korsas med en normal vildtyp (grå) mus, vilket ger avkommor som är antingen vita och heterozygota för den utslagna genen, eller grå och vildtyp. Vita heterozygota möss kan sedan avlas för att producera möss som är homozygota för genen knockout.

Det finns flera variationer i proceduren för att skaffa knockoutmöss; nedan är ett typiskt exempel.

Den nya sekvensen från steg 1 introduceras i stamcellerna från steg 2 genom elektroporering. Som ett resultat av den naturliga processen med homolog rekombination kommer några av de elektroporerade stamcellerna att införliva den nya knockout-gensekvensen i sina kromosomer i stället för den ursprungliga genen. Chanserna för en lyckad rekombinationshändelse är relativt låg, så de flesta förändrade celler kommer bara att ha den nya sekvensen på en av de två motsvarande kromosomerna - de anses vara heterozygota. Celler som har transformerats med en vektor innehållande en neomycinresistensgen och en herpes tk+-gen odlas i en lösning innehållande neomycin och ganciklovir för att selektera för transformationer som har skett genom homolog rekombination. Varje DNA-insättning som sker som ett resultat av en oavsiktlig insättning kommer att dö eftersom de testar positivt för både neomycinresistensgenen och tk+ herpesgenprodukten, vars genprodukt reagerar med ganciklovir och bildar ett dödligt toxin. Dessutom testar celler som inte integrerar något av de genetiska materialen negativt för båda generna och dör därför som ett resultat av neomycinförgiftning.

Embryonala stamceller som inkluderade knockout-genen isoleras från oförändrade celler med hjälp av markörgenen från steg 1. Till exempel kan oförändrade celler dödas med ett toxiskt medel som de förändrade cellerna är resistenta mot. Knockout embryonala stamceller från steg 4 injiceras i en musblastocyst. För det här exemplet använder vi gråmusblastocyster. Blastocyster innehåller nu två typer av stamceller: original (från en grå mus) och knockout-celler (från en vit mus). Dessa blastocyster implanteras sedan i livmodern på honmöss, där de utvecklas. Således kommer nyfödda möss att vara chimärer: vissa delar av deras kroppar bildas från de ursprungliga stamcellerna, andra från utslagna stamceller. Deras päls kommer att visa vita och grå fläckar, med vita fläckar som kommer från utslagna stamceller och grå fläckar från mottagarens blastocyst. Vissa nyfödda chimärmöss kommer att ha gonader som härrör från utslagna stamceller och kommer därför att producera ägg eller spermier som innehåller den utslagna genen. När dessa chimärmöss korsas med andra vildtypsmöss kommer några av deras avkommor att ha en kopia av knockout-genen i alla sina celler. Dessa möss behåller inget gråmus-DNA och är inte chimärer, men de är fortfarande heterozygota. När dessa heterozygota avkommor korsar sig kommer en del av deras avkommor att ärva knockout-genen från båda föräldrarna; de bär inte en funktionell kopia av den ursprungliga oförändrade genen (det vill säga de är homozygota för den allelen). En detaljerad förklaring av hur knockout (KO) möss skapas finns på 2007 års Nobelpris i fysiologi eller medicin webbplats [5] .

Begränsningar

National Institutes of Health diskuterar några viktiga begränsningar av denna teknik [6] .

Liksom alla laboratoriemöss har knockoutmöss inte god immunitet mot naturliga sjukdomar. Men detta kompenseras av deras höga känslighet för den specifika patogen som de är skapade för.

Medan knockout-musteknologi är ett värdefullt forskningsverktyg, finns det några viktiga begränsningar. Cirka 15 procent av genknockouts är utvecklingsmässigt dödliga, vilket innebär att de genetiskt modifierade embryona inte kan växa till vuxna möss. Detta problem övervinns ofta med villkorade mutationer. Bristen på vuxna möss begränsar forskningen till embryonal utveckling och gör det ofta svårt att avgöra genens funktion i förhållande till människors hälsa. I vissa fall kan en gen utföra en annan funktion hos vuxna än vad den gör för att utveckla embryon.

Att slå ut en gen kanske inte heller resulterar i märkbara förändringar hos musen, eller kan till och med resultera i egenskaper som skiljer sig från de som ses hos människor som har samma gen inaktiverad. Till exempel är mutationer i p53-genen associerade med mer än hälften av mänskliga cancerformer och leder ofta till tumörer i en specifik uppsättning vävnader. Men när p53-genen slås ut i möss, utvecklar djuren tumörer i en annan vävnadsuppsättning.

Det finns variation under hela proceduren, till stor del beroende på vilken stam stamcellerna erhölls från. Vanligtvis används celler som härrör från stam 129. Denna specifika stam är inte lämplig för många experiment (t.ex. beteendemässiga), så det är mycket vanligt att backkorsa avkomma med andra stammar. Vissa genomiska loci har visat sig vara mycket svåra att identifiera. Orsakerna kan vara närvaron av repetitiva sekvenser, omfattande DNA-metylering eller heterokromatin. Den förvirrande närvaron av närliggande 129 gener i ett knockout-segment av det genetiska materialet har kallats den "flankerande geneffekten". [7] Metoder och riktlinjer har föreslagits för att hantera detta problem [7] .

En annan begränsning är att normala (d.v.s. obetingade) knockoutmöss utvecklas i frånvaro av genen som studeras. Ibland kan förlust av aktivitet under utveckling maskera rollen av en gen i vuxen ålder, särskilt om genen är involverad i flera processer som spänner över utveckling. Sedan krävs villkorade/inducerbara mutationsmetoder som först tillåter musen att utvecklas och mogna normalt tills genen av intresse tas bort.

En annan stor begränsning är bristen på evolutionära anpassningar i knockout-modellen som kan förekomma hos vildtypsdjur efter deras naturliga mutation. Till exempel är erytrocytspecifik samuttryck av GLUT1 med stomatin en kompensationsmekanism hos däggdjur som inte kan syntetisera C-vitamin [8] .

Anteckningar

1. ↑ Helen R. Pilcher. Det är en knockout   // Nature . - 2003. - doi : 10.1038/news030512-17 .
2. ↑ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN. Produktion av knockout-råttor med ENU-mutagenes och en jästbaserad screeninganalys  //  Nature Biotechnology. - 2003. - Vol. 21 , iss. 6 . — S. 645–51 . - doi : 10.1038/nbt830 . — PMID 12754522 .
3. ↑ Shchelkunov S. N. Genteknik . - Siberian University Publishing House, 2004. - S. 453. (ryska)
4. ↑ Rizvanova A. Kh. Bioetiska principer och genteknik . - 2013. - S. 2. (ryska)
5. ↑ Nobelpriset i  medicin 2007 . nobelprize.org . Hämtad 21 januari 2022. Arkiverad från originalet 25 juni 2018.
6. ↑ Faktablad om knockout möss Arkiverad 16 december 2018 på Wayback Machine / National Human Genome Research Institute
7. ↑ 1 2 Robert Gerlai. Geninriktade studier av däggdjurs beteende: är det mutationen eller bakgrundsgenotypen?  (engelska)  // Trends in Neurosciences. - 1996. - Maj (bd 19). - S. 177-181 . — ISSN 0166-2236 . - doi : 10.1016/S0166-2236(96)20020-7 .
8. ↑ Crusio WE, Goldowitz D., Holmes A., Wolfer D. Standarder för publicering av musmutantstudier  //  Gener, Brain and Behavior. - 2009. - 28 januari (bd 8). - S. 1-4 . — ISSN 1601-1848 . - doi : 10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x .

Ordböcker och uppslagsverk	Britannica (online)