Koleratoxin ( kolerogen [1] ) är ett multisubunit protein exotoxin som produceras av Vibrio cholerae . Vibrio (en virulent stam av Vibrio cholerae [1] [2] utsöndrar koleratoxin efter att bakterien kommit in i människokroppen. CT:s verkan orsakar intensiv uttorkning efter starten av den aktiva fasen av kolerainfektion . Vid penetration in i cellerna i en infekterad organism, en av subenheterna av detta toxin katalyserar ADP-ribosylering Gsα-komponent av adenylatcyklas , vilket leder till dess hyperaktivering [2] .. Ökad aktivitet av adenitalcyklas leder till störningar av jontransporten genom membranet av tarmceller : intaken av natriumjoner (och med dem vatten) minskar och utflödet av anjoner (och med dem vatten) ökar. Som ett resultat sker en snabb förlust av vatten från tarmceller, som i vissa fall når två liter per timme.
Koleratoxin är ett oligomert protein som består av sex subenheter. En av dessa subenheter är typ A. Denna subenhet har katalytisk aktivitet. De återstående fem subenheterna är av typ B. De krävs för bindningen av koleratoxin till det humana cellreceptorproteinet. Den rumsliga strukturen för koleratoxin erhölls av Zhang et al. (Zhang et al.) 1995.[3] B-underenheter av koleratoxin är små proteiner. Molekylvikten för B-subenheten är 12 kDa. I koleratoxinmolekylen bildar B-subenheterna en ring. I A-subenheten särskiljs två domäner sammankopplade med en disulfidbindning: A1 (CTA1) är ett enzym som binder ADP-ribos till G-proteiner, A2 (CTA2) har formen av en alfahelix, som är belägen inuti de fem -ledad ring bildad av B-subenheter. [ fyra] Strukturen av koleratoxin, katalytisk mekanism och sekvens liknar coli-toxin.
Koleratoxin kommer in i tarmepitelcellerna (enterocyter) via receptorberoende endocytos . I cellens cytoplasma återställs disulfidbindningen mellan A1- och A2-domänerna och A1 (CTA1) dissocierar från komplexet. A1-subenheten har förmågan att fästa ADP-ribos till den trimera Gsα-komponenten av adenylatcyklas. Som ett resultat av denna reaktion aktiveras adenylatcyklas och börjar syntetisera cAMP. I sin tur startar cAMP signalvägen , vilket leder till utflödet av kloridjoner och andra anjoner från cellen genom CFTR-kanaler och till att natriumjoner upphör att komma in i cellen. Ytterligare utflöde av natriumjoner sker tillsammans med anjoner. Natriumjoner samtransporteras med vattenmolekyler, så koncentrationen av vatten i cellen under dessa processer reduceras avsevärt. Brott mot vatten-saltbalansen leder till diarré, där kroppen förlorar upp till 2 liter vatten per timme. Uttorkning inträffar, och patientens avföring får den karakteristiska konsistensen av "risvatten" på grund av enterocyter separerade från tarmväggen. Noterbart verkar pertussis-toxinet (också ett AB5-protein med fem subenheter) som produceras av Bordetella pertussis på människokroppen på liknande sätt, förutom att pertussis-toxinet fäster ADP-ribos till Gai-subenheten och håller den i ett inaktivt tillstånd. Gai-inaktivitet förhindrar hämning av humant adenylatcyklas och ökar cAMP-syntesen i cellen [6].
Efter utsöndring binder B-subenheten av koleratoxin till GM1-gangliosiden som finns på enterocytens yttre cellmembran. Efter bindning kommer koleratoxin (hela komplexet) in i cellen genom endocytos. I detta skede förstörs ringen och på grund av återställandet av disulfidbindningar frigörs CTA1-domänen, som tidigare ingick i subenhet A. Endosomen kommer in i Golgi-apparaten, där CTA1 interagerar med den endoplasmatiska retikulumchaperonen, proteinet disulfid-isomeras, lindas upp och transporteras av chaperonen till cellmembranregionen genom Sec61-kanalen. I membranet interagerar CTA1 med oxidoreduktaset Ero1, CTA1 frisätts från komplexet med chaperonen på grund av oxidation och veck på ett sådant sätt att ubiquitination av cellenzymer och efterföljande förstörelse undviks. CTA1 binder sedan till ADP-ribosyleringsfaktor 6 (Arf6), vilket stimulerar den katalytiska aktiviteten av CTA1. Sålunda klyver komplexet av CTA1 och Arf6 NAD och överför den resulterande ADP-ribosen till G-protein, den regulatoriska subenheten av endogent adenylatcyklas. Detta leder till det faktum att Gαs behåller förmågan att binda GTP, men förlorar förmågan att hydrolysera det, det vill säga att det förblir i ett aktiverat tillstånd. Som ett resultat ackumuleras cAMP i cellen. I allmänhet kan dess koncentration öka med mer än 100 gånger.
Genen som kodar för koleratoxin kan ha uppstått i V. cholerae genom vad som kallas horisontell genöverföring . Virulenta stammar av Vibrio cholerae är infekterade med bakteriofagen CTXf eller CTXφ ;.[7]
Trots sitt formidabla namn har koleratoxin en ganska fridfull användning. Inom området stamcellsforskning används koleratoxin i stor utsträckning som tillsats i odlingsmedier . Detta är nödvändigt för att förhindra celldifferentiering och upprätthålla en viss nivå av proliferation i cellkultur . Koncentrationen av koleratoxin i odlingsmedier är 0,1 nmol/L.
B-subenheten, som i sig inte är cytotoxisk , används som spårämne. Kärnan i metoden är att en fluorescerande märkning eller antikropp (en immunglobulin G- molekyl ) sys kemiskt till B-subenheten . Genom att binda till en cell som bär en specifik gangliosid märker den modifierade B-subenheten cellen.
Patogeniciteten av koleratoxin som sådant i form av lösning, aerosol etc. verkar vara tveksam. Proteinet som sådant produceras inte in vivo i frånvaro av vibrio, dess effekt på celler är avsevärt tidsbegränsad och, liksom alla andra proteiner, är det föremål för nedbrytning i matsmältningskanalen.
På marknaden för biologiska läkemedel säljs koleratoxin i små partier, såsom Sigma-Aldrich , i 10 mg förpackningar, vilket minimerar risken för avsiktlig eller olämplig användning utanför väggarna på ett vetenskapligt laboratorium.