Exonukleaser är proteiner från gruppen av nukleaser som klyver terminala mononukleotider från en polynukleotidkedja genom hydrolys av fosfodiesterbindningar mellan nukleotider.
Beroende på förmågan att hydrolysera bindningar vid 3'- och 5'-ändarna av polynukleotidkedjan, särskiljs 3'- och 5'-exonukleaser. Exonukleaser finns i celler både separat och som en del av enzymatiska komplex. Till exempel innehåller DNA-polymeras I ett 5'-exonukleas som klyver bort en RNA-primer fäst direkt till stället där DNA-syntes sker. Efter det börjar DNA-polymeras I att lägga till nukleotider till platsen för den lossade primern. Hos arkebakterier och eukaryoter utförs en av huvudvägarna för RNA- nedbrytning av ett proteinkomplex som huvudsakligen består av 3'- och 5'-exoribonukleaser.