Restriktionsendonukleaser

Restriktionsendonukleaser, restriktionsenzymer (från latin  restrictio  - restriction) - en grupp enzymer som tillhör klassen hydrolaser som katalyserar hydrolysreaktionen av nukleinsyror .

Till skillnad från exonukleaser klyver restriktionsenzymer inte nukleinsyror från molekylens ände, utan i mitten. Samtidigt känner varje restriktionsenzym igen en viss DNA- sektion med en längd av fyra baspar och klyver nukleotidkedjan inuti igenkänningsstället eller utanför det.

Skydd av bakteriegenomet från dess eget restriktionsenzym utförs genom metylering av nukleotidresterna av adenin och cytosin (maskering) [1] .

När restriktion utförs under suboptimala förhållanden, uppvisar endonukleaser stjärnaktivitet (en minskning i restriktionsspecificitet).

Klassificering

Det finns tre huvudtyper (eller klasser) av restriktionsenzymer , vars igenkänningsställen kan vara symmetriska ( palindromiska ) och asymmetriska [2] :

• Restriktionsenzymer av den första typen (till exempel Eco K från Escherichia coli K12) känner igen en viss nukleotidsekvens och skär en dubbelsträngad DNA-molekyl nära denna sekvens vid en godtycklig punkt, och själva skärningsstället är inte strikt specifikt (uppenbarligen, efter bildandet av ett komplex med DNA, interagerar enzymet ospecifikt med deleterad DNA-region eller rör sig längs DNA-strängen).
• Restriktionsenzymer av den andra typen (till exempel EcoRI , Xbal ) känner igen en viss sekvens och skär DNA-dubbelhelixen vid en viss fast punkt inom denna sekvens. Restriktionsenzymer av denna typ känner igen palindromiska sekvenser som har en central axel och avläses lika på båda sidor om symmetriaxeln.
• Restriktionsenzymer av den tredje mellanliggande typen (till exempel Eco PI) känner igen den önskade sekvensen och skär den dubbelsträngade DNA-molekylen och drar tillbaka ett visst antal nukleotidpar från dess ände (eller på flera punkter på olika avstånd från igenkänningsstället) . I detta fall bildas DNA-fragment antingen med släta (trubbiga) ändar eller med utskjutande (klibbiga) 5'- eller 3'-ändar. Dessa restriktionsenzymer känner igen asymmetriska ställen. Dessa egenskaper används i stor utsträckning i olika in vitro DNA-sammansättningsmetoder , såsom Golden Gate-montering .

År 2007 hade mer än tre tusen restriktionsendonukleaser isolerats. [3] Mer än sexhundra restriktaser är kommersiellt tillgängliga och används rutinmässigt i laboratorier för DNA-modifiering och genteknik . [4] [5] [6]

Isoschisomers

Isoschizomerer är par av restriktionsendonukleaser som har en specificitet för att känna igen samma sekvenser, men som ibland skiljer sig åt i närvaro av metylerade nukleotidrester , och skär dessa sekvenser på samma ställen. Till exempel är restriktionsenzymerna Sph I (CGTAC^G) och Bbu I (CGTAC^G) isoschizomerer. Det första isolerade enzymet för igenkänning och specifik skärning av en given sekvens kallas en prototyp , och alla andra liknande restriktionsenzymer kallas isoschizomerer .

Isoschisomerer isoleras från olika bakteriestammar och därför kan olika isoschisomerer kräva olika reaktionsförhållanden .

Heteroschizomerer (neoschizomerer)

Ett enzym som känner igen samma sekvens men skär den annorlunda kallas heteroschizomer (neoschizomer) . Isoschizomerer är alltså ett specialfall av heteroschizomerer. Till exempel är restriktionsenzymerna Sma I (GGG^CCC) och Xma I (G^GGCCC) heteroschizomerer, men inte isoschizomerer för varandra.

Isocaudomers

Restriktionsenzymer som känner igen helt olika sekvenser men bildar samma ändar kallas isokaudomerer .

Artificiella restriktionsenzymer

Inom genteknik används artificiella restriktaser i stor utsträckning, erhållna genom fusion av zinkfingrets DNA-bindande domän med nukleasets DNA-skärande domän [7] [8] . Zinkfingerdomänen kan utformas för att känna igen och binda till en önskad DNA-sekvens [9] . Ett alternativ till zinkfingernukleaser är artificiella restriktionsenzymer TALEN som erhålls genom att fusionera den DNA-bindande domänen av TAL-effektorn med DNA-klyvningsdomänen [10] [11] [12] [13] .

RNA-ledda endonukleaser

För att redigera genomet i mänskliga celler används också endonukleaser från CRISPR - Cas9- systemet , som klyver vissa DNA-sekvenser i "spetsen" av komplementärt RNA [14] [15] [16] [17] [18] [19] . Till skillnad från zinkfingrar och TALEN kräver CRISPR-Cas-systemet för DNA-igenkänning endast skapandet av en lämplig "guide" RNA-sekvens, och inte skapandet av nya proteindomäner av enzymet, vilket gör denna metod mycket mer tillgänglig på grund av dess enkelhet och relativt låg kostnad [20] [21 ] [22] [23] [24] .

Betydelse

Inom praktisk molekylärbiologi används oftast restriktionsenzymer av typ II, vars igenkänningsställe i de flesta fall är ett palindrom . Alla restriktaser av typ II är Mg2 + -beroende.

Restriktionsenzymer är en del av ett komplext restriktionsmodifieringssystem som används av bakterieceller för att reglera innehållet och aktiviteten av DNA i cellen.

Upptäckten av restriktionsenzymer på 1970 -talet, tillsammans med utvecklingen av DNA-sekvenseringsmetoder , var den främsta drivkraften för utvecklingen av genteknik .

För närvarande är restriktionsenzymer med olika igenkänningsställen det huvudsakliga verktyget för genetisk forskning och genteknik .

Se även

• Restriktion-modifieringssystem
• DNA-fotavtryck
• REBAS
• CRISPR Cas13

Anteckningar

1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Molecular biology of the cell: in three volumes. - 2. - Moskva: Mir, 1994. - T. 1. - 517 sid. — 10 000 exemplar.  — ISBN 5030019855 .
2. ↑ Ayala F. D. Modern genetik. 1987.
3. ↑ Roberts RJ, Vincze T., Posfai J., Macelis D.  REBASE --enzymer och gener för DNA-restriktion och modifiering  // Nucleic Acids Res : journal. - 2007. - Vol. 35 , nr. Databasproblem . - P.D269-70 . doi : 10.1093 / nar/gkl891 . — PMID 17202163 .
4. ↑ Primrose, Sandy B.; Old, RW Principer för genmanipulation: en introduktion till  genteknik . - Oxford: Blackwell Scientific , 1994. - ISBN 0-632-03712-1 .
5. ↑ Micklos, David A.; Bloom, Mark V.; Freyer, Greg A. Laboratorie-DNA-vetenskap: en introduktion till rekombinanta DNA-tekniker och metoder för  genomanalys . — Menlo Park, Kalifornien: Benjamin/Cummings Pub. Co, 1996. - ISBN 0-8053-3040-2 .
6. ↑ Adrianne Massey; Helen Kreuzer. Rekombinant DNA och bioteknik: En guide för  studenter . -Washington, DC: ASM Press, 2001. - ISBN 1-55581-176-0 .
7. ↑ Carroll, D. (2011) Genomteknik med zinkfingernukleaser. Genetics, 188(4), 773-782. doi : 10.1534/genetics.111.131433
8. ↑ Fujii W, Kano K, Sugiura K, Naito K (2013) Repeterbar konstruktionsmetod för konstruerad zinkfingernukleas baserad på PCR för överlappningsförlängning och TA-kloning. PLoS ONE 8(3): e59801. doi : 10.1371/journal.pone.0059801
9. ↑ Zhu, C., Gupta, A., Hall, VL et al. & Wolfe, SA (2013). Användning av definierade finger-finger-gränssnitt som sammansättningsenheter för att konstruera zink-finger-nukleaser. Nukleinsyraforskning, 41(4), 2455-246541 doi : 10.1093/nar/gks1357 .
10. ↑ Mussolino, C., & Cathomen, T. (2012). TALE nukleaser: skräddarsydd genomteknik på ett enkelt sätt. Current Opinion in Biotechnology, 23(5), 644-650 doi : 10.1016/j.copbio.2012.01.013
11. ↑ Beumer, KJ, Trautman, JK, Christian, M., et al. & Carroll, D. (2013). Jämförelse av zinkfingernukleaser och transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser för geninriktning i Drosophila. G3: Gener| Genom| Genetics, 3(10), 1717-1725 doi : 10.1534/g3.113.007260
12. ↑ Sun, N., & Zhao, H. (2013). Transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALENs): Ett mycket effektivt och mångsidigt verktyg för genomredigering. Biotechnology and bioengineering, 110(7), 1811-1821 doi : 10.1002/bit.24890
13. ↑ Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y (2013) Snabb sammansättning av kundanpassade TALENS till flera leveranssystem. PLoS ONE 8(11): e80281. doi : 10.1371/journal.pone.0080281
14. ↑ Cho, SW, Kim, S., Kim, JM, & Kim, JS (2013). Riktad genomteknik i mänskliga celler med Cas9 RNA-guidad endonukleas. Nature biotechnology, 31, 230-232. doi : 10.1038/nbt.2507
15. ↑ Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, et al. & Zhang, F. (2013) DNA-inriktningsspecificitet för RNA-ledda Cas9-nukleaser. Nature biotechnology, 31(9), 827-832. doi : 10.1038/nbt.2647
16. ↑ Golic, KG (2013) RNA-Guided Nucleases: A New Era for Engineering the Genomes of Model and Nonmodel Organisms. Genetics, 195(2), 303-308. doi : 10.1534/genetics.113.155093
17. ↑ Ran, F.A., Hsu, P.D., Wright, J., et al. & Zhang, F. (2013). Genomteknik med CRISPR-Cas9-systemet. Nature protocols, 8(11), 2281-2308 doi : 10.1038/nprot.2013.143
18. ↑ Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) RNA-beroende DNA-endonukleas Cas9 från CRISPR-systemet: Helig gral av genomredigering? Arkiverad 5 december 2013 på Wayback Machine Trends in Microbiology, 21(11), 562-567, doi : 10.1016/j.tim.2013.09.001
19. ↑ Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak och George Church (2014) CRISPR-Cas Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. I: Gene Correction. Metoder och protokoll. Serie: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
20. ↑ Uri Ben-David (2013) Flödar genom CRISPR-CAScade: Kommer genomredigering att öka cellterapier? Arkiverad 17 november 2015 på Wayback Machine Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi : 10.1186/ 2052-8426-1-3
21. ↑ Neena K. Pyzocha, F. Ann Ran, Patrick D. Hsu och Feng Zhang (2014) RNA-Guided Genome Editing of Mammalian Cells. I: Gene Correction. Metoder och protokoll. Serie: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
22. ↑ Li, M., Suzuki, K., Kim, NY, Liu, GH, & Belmonte, JCI (2013). Ett snitt över resten: riktade genomredigeringstekniker i mänskliga pluripotenta stamceller. Journal of Biological Chemistry, jbc-R113. doi : 10.1074/jbc.R113.488247
23. ↑ Slaymaker, IM, Gao, L., Zetsche, B., Scott, DA, Yan, WX, & Zhang, F. Rationellt konstruerade Cas9-nukleaser med förbättrad specificitet  //  Science : journal. - 2016. - Vol. 351 , nr. 6268 . - S. 84-88 . - doi : 10.1126/science.aad5227 .
24. ↑ Kleinstiver BP, Pattanayak V., Prew MS, , & J. Keith Joung et al. High-fidelity CRISPR–Cas9 nukleaser utan detekterbara genomomfattande effekter utanför målet  (engelska)  // Nature : journal. - 2016. - doi : 10.1038/nature16526 .

Ordböcker och uppslagsverk	Britannica (online) Universalis
I bibliografiska kataloger	J9U : 987007533913205171 LCCN : sh85113284