RecBCD

RecBCD ( exonukleas V, RecBC-deoxiribonukleas ) är ett enzym av bakterien Escherichia coli som initierar processen för homolog rekombination under reparation av dubbel- och enkelsträngad skada av DNA- molekylen till följd av joniserande strålning , fel i replikeringsprocess , fel i arbetet med endonukleaser , eller som ett resultat av oxidativ stress [1] [2] . RecBCD är både en helikas som lindar upp den dubbla helixen av DNA och ett nukleas som skär den [3] .

RecBCD används i singelmolekylen FRET -metoden , som används för att studera interaktionen mellan proteiner och DNA [4] .

Struktur

RecBCD är ett proteinkomplex som består av tre olika subenheter : RecB, RecC och RecD. Innan upptäckten av RecD -genen [5] var komplexet känt som RecBC. Varje subenhet kodas av en separat gen:

Funktioner

RecD och RecC är helikaser, det vill säga ATP -drivna molekylära komplex som lindar upp DNA, eller, i vissa fall, RNA , medan RecB också utför funktionen av ett nukleas [6] . RecC, den tredje subenheten av RecBCD-komplexet, känner igen en specifik sekvens i DNA, nämligen 5'-GCTGGTGG-3 ' , känd som Chi-stället, vid vilket DNA:t skärs i skedet av rekombinationens fullbordande. RecBCD är ovanligt genom att båda dess helikaser rör sig längs kedjan med olika hastigheter [7] och genom att de känner igen en specifik DNA-sekvens (Chi site) [8] [9] . RecBCD binder till slutet av dubbelsträngat DNA och börjar linda upp det, medan RecD rör sig från 5'-änden till 3'-änden och RecB vice versa. Under rörelsen finns två DNA-strängar kvar bakom RecBCD, som bildar en slinga, och eftersom RecB rör sig långsammare än RecD, växer slingan av den senare snabbare; den resulterande strukturen i form av ett RecBCD-komplex som rör sig längs en kedja med två öglor bakom kallas ibland "kaninöron" på grund av dess yttre likhet [10] .

De indirekta funktionerna hos RecBCD inkluderar dess roll i aktiveringen av effektorn som skyddar bakteriekulturen från virusinfektion. [elva]

Verkningsmekanism

Under DNA-avveckling kan RecB-nukleassubenheten agera annorlunda, beroende på reaktionsbetingelserna, i synnerhet beroende på koncentrationen av Mg 2+-joner och ATP. Om det finns ett överskott av ATP, klipper enzymet helt enkelt kedjan som innehåller Chi-stället [12] . Avvecklingen av kedjan fortsätter och en 3'-svans bildas med en Chi-site, på vilken RecA -proteinet kan landa , vilket underlättar införandet av denna svans i kromosomen , som kommer att vara en mall för att reparera den skadade kedja och byta kedjor med den [13] . Den Chi-plats-igenkännande subenheten av RecBCD-komplexet interagerar inte med andra sekvenser, och enzymet bryts snart ner i subenheter, förblir inaktivt i en timme eller mer [14] . Om det finns ett överskott av Mg 2+-joner , klyver RecBCD, som ett endonukleas , båda DNA-strängarna, även om 5'-änden klyvs mer sällan [15] . När RecBCD stöter på Chi-platsen upphör avvecklingen och 3'-strängsnedbrytningen saktar ner [16] . Medan man fortsätter att varva ner DNA:t skär RecBCD omedelbart den motsatta strängen (d.v.s. 5'-änden) [17] [18] och laddar RecA-proteinet i 3'-änden. Efter att ha slutfört denna process på en DNA-molekyl upprepar enzymet den igen och byter snabbt till en ny molekyl [13] .

Även om reaktionerna inte har verifierats genom DNA-analys i själva cellerna på grund av deras förgänglighet, visar genetiska data att den första reaktionen är mest lik den som sker i cellen [1] . Till exempel behåller en mutant RecBCD som saknar experimentellt bestämd exonukleasaktivitet en hög förmåga att klyva Chi-stället under extracellulära förhållanden [19] . Chi-stället på en DNA-molekyl i celler hämmar aktiviteten hos Chi-stället på ett annat, vilket kan återspegla Chi-beroende RecBCD-demontering, vilket observeras in vitro under förhållanden med överskott av ATP och i närvaro av ett brott i DNA i region av Chi-platsen [20] [21] .

Under båda reaktionsbetingelserna förblir 3'-änden intakt efter Chi-stället, bredvid vilket RecA-proteinet laddas aktivt på DNA-strängen. Vid någon obestämd punkt bryts RecBCD ner, även om den kan varva ner minst 60 tusen baspar av DNA medan den förblir intakt. RecA initierar ett utbyte av DNA-strängar med en identisk eller nästan identisk mallmolekyl; detta utbyte skapar en struktur som kallas en D-loop . Den resulterande strukturen av två DNA-duplex med korsade strängar kan lösas på två sätt: antingen kommer 3'-strängen med Chi-stället infört i mallmolekylen att fungera som en primer för att starta DNA- syntes , eller så kommer D-slingan att klyvas att bilda Holliday-strukturen . I sin tur löses Holliday-strukturen av RuvABC- komplexet eller av RecG-proteinet. Var och en av dessa händelser leder till uppkomsten av ett helt DNA, som skiljer sig från föräldern genom nya kombinationer av gener. Denna process, känd som homolog rekombination , fullbordar reparationen av dubbelsträngbrottet [13] .

Anteckningar

1. ↑ 1 2 Smith GR Hur RecBCD-enzym och Chi främjar reparation och rekombination av DNA-brott: en molekylärbiologs syn.  (engelska)  // Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. - 2012. - Vol. 76, nr. 2 . - S. 217-228. - doi : 10.1128/MMBR.05026-11 . — PMID 22688812 .
2. ↑ Spies M., Kowalczykowski SC Homolog rekombination med RecBCD- och RecF-vägar // Bakteriella kromosomer  (neopr.) / Higgins P.. - Washington, DC: ASM Press, 2003. - S. 389-403. — ISBN 1-55581-232-5 .
3. ↑ Singleton MR , Dillingham MS , Gaudier M. , Kowalczykowski SC , Wigley DB Kristallstruktur av RecBCD-enzym avslöjar en maskin för bearbetning av DNA-avbrott.  (engelska)  // Nature. - 2004. - Vol. 432, nr. 7014 . - S. 187-193. - doi : 10.1038/nature02988 . — PMID 15538360 .
4. ↑ Bianco PR , Brewer LR , Corzett M. , Balhorn R. , Yeh Y. , Kowalczykowski SC , Baskin RJ Processiv translokation och DNA-avveckling av individuella RecBCD-enzymmolekyler.  (engelska)  // Nature. - 2001. - 18 januari ( vol. 409 , nr 6818 ). - s. 374-378 . - doi : 10.1038/35053131 . — PMID 11201750 .
5. ↑ Amundsen SK , Taylor AF , Chaudhury AM , Smith GR recD: genen för en väsentlig tredje subenhet av exonukleas V.  //  Proceedings Of The National Academy of Sciences of the United States Of America. - 1986. - August ( vol. 83 , nr 15 ). - P. 5558-5562 . - doi : 10.1073/pnas.83.15.5558 . — PMID 3526335 .
6. ↑ Yu M. , Souaya J. , Julin DA . Den 30 kDa C-terminala domänen av RecB-proteinet är kritisk för nukleasaktiviteten, men inte helikasaktiviteten, av RecBCD-enzymet från Escherichia coli.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States Of America. - 1998. - 3 februari ( vol. 95 , nr 3 ). - s. 981-986 . - doi : 10.1073/pnas.95.3.981 . — PMID 9448271 .
7. ↑ Taylor AF , Smith GR RecBCD-enzym är en DNA-helikas med snabba och långsamma motorer med motsatt polaritet.  (engelska)  // Nature. - 2003. - Vol. 423, nr. 6942 . - s. 889-893. - doi : 10.1038/nature01674 . — PMID 12815437 .
8. ↑ Taylor AF , Smith GR RecBCD-enzym förändras vid skärning av DNA vid en chi-rekombinationshotspot.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States Of America. - 1992. - 15 juni ( vol. 89 , nr 12 ). - P. 5226-5230 . - doi : 10.1073/pnas.89.12.5226 . — PMID 1535156 .
9. ↑ Amundsen SK , Taylor AF , Reddy M. , Smith GR Intersubunit-signalering i RecBCD-enzym, en komplex proteinmaskin som regleras av Chi-hot spots.  (engelska)  // Gener och utveckling. - 2007. - Vol. 21, nr. 24 . - P. 3296-3307. - doi : 10.1101/gad.1605807 . — PMID 18079176 .
10. ↑ Taylor A. , ​​​​Smith GR Avlindning och återlindning av DNA med RecBC-enzymet.  (engelska)  // Cell. - 1980. - November ( vol. 22 , nr 2 Pt 2 ). - S. 447-457 . — PMID 6256081 .
11. ↑ Retroner är en viktig del av den medfödda immuniteten hos bakterier • Elena Naimark • Vetenskapsnyheter om element • Genetik, mikrobiologi . Hämtad 23 november 2020. Arkiverad från originalet 23 november 2020. (obestämd)
12. ↑ Taylor AF , Schultz DW , Ponticelli AS , Smith GR RecBC-enzym som hackar på Chi-ställen under DNA-avveckling: placering och orienteringsberoende av skärningen.  (engelska)  // Cell. - 1985. - Maj ( vol. 41 , nr 1 ). - S. 153-163 . — PMID 3888405 .
13. ↑ 1 2 3 Anderson DG , Kowalczykowski SC Det translokerande RecBCD-enzymet stimulerar rekombination genom att rikta RecA-protein på ssDNA på ett chi-reglerat sätt.  (engelska)  // Cell. - 1997. - 11 juli ( vol. 90 , nr 1 ). - S. 77-86 . — PMID 9230304 .
14. ↑ Taylor AF , Smith GR Reglering av homolog rekombination: Chi inaktiverar RecBCD-enzymet genom demontering av de tre subenheterna.  (engelska)  // Gener & Development. - 1999. - 1 april ( vol. 13 , nr 7 ). - P. 890-900 . — PMID 10197988 .
15. ↑ Dixon DA , Kowalczykowski SC Rekombinationshotspot-chi är en regulatorisk sekvens som verkar genom att försvaga nukleasaktiviteten hos E. coli RecBCD-enzymet.  (engelska)  // Cell. - 1993. - 9 april ( vol. 73 , nr 1 ). - S. 87-96 . — PMID 8384931 .
16. ↑ Spies M. , Amitani I. , Baskin RJ , Kowalczykowski SC RecBCD-enzymväxlar blymotoriska subenheter som svar på chiigenkänning.  (engelska)  // Cell. - 2007. - Vol. 131, nr. 4 . - s. 694-705. - doi : 10.1016/j.cell.2007.09.023 . — PMID 18022364 .
17. ↑ Taylor AF , Smith GR Strandspecificitet för hackning av DNA vid Chi-ställen av RecBCD-enzym. Modulering av ATP- och magnesiumnivåer.  (engelska)  // The Journal Of Biological Chemistry. - 1995. - 13 oktober ( vol. 270 , nr 41 ). - P. 24459-24467 . — PMID 7592661 .
18. ↑ Anderson DG , Kowalczykowski SC Rekombinationshot spot-chi är ett reglerande element som byter polaritet för DNA-nedbrytning av RecBCD-enzymet.  (engelska)  // Gener & Development. - 1997. - 1 mars ( vol. 11 , nr 5 ). - s. 571-581 . — PMID 9119222 .
19. ↑ Amundsen SK , Smith GR Chi-hotspot-aktivitet i Escherichia coli utan RecBCD-exonukleasaktivitet: implikationer för rekombinationsmekanismen.  (engelska)  // Genetik. - 2007. - Januari ( vol. 175 , nr 1 ). - S. 41-54 . - doi : 10.1534/genetics.106.065524 . — PMID 17110484 .
20. ↑ Köppen A. , Krobitsch S. , Thoms B. , Wackernagel W. Interaktion med rekombinationshot spot chi in vivo omvandlar RecBCD-enzymet från Escherichia coli till ett chi-oberoende rekombinas genom inaktivering av RecD-subenheten.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States Of America. - 1995. - 3 juli ( vol. 92 , nr 14 ). - P. 6249-6253 . - doi : 10.1073/pnas.92.14.6249 . — PMID 7541534 .
21. ↑ Myers RS , Kuzminov A. , Stahl FW Rekombinationshot spot-chi aktiverar RecBCD-rekombination genom att omvandla Escherichia coli till en recD-mutant fenokopi.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States Of America. - 1995. - 3 juli ( vol. 92 , nr 14 ). - P. 6244-6248 . - doi : 10.1073/pnas.92.14.6244 . — PMID 7603978 .

Ordböcker och uppslagsverk	Britannica (online)