Restriktionsmodifieringssystemet är ett enzymsystem av bakterier som förstör främmande DNA som har kommit in i cellen . Dess huvudsakliga funktion är att skydda cellen från främmande genetiskt material, såsom bakteriofager och plasmider . Komponenterna i systemet kännetecknas av två typer av aktivitet - metyltransferas (metylas) och endonukleas . Både enskilda proteiner och ett protein som kombinerar båda funktionerna kan vara ansvariga för vart och ett av dem . [ett]
Restriktionsmodifieringssystemet (SR-M) är specifikt för vissa sekvenser av nukleotider i DNA, så kallade restriktionsställen . Om vissa nukleotider i sekvensen inte är metylerade , introducerar restriktionsendonukleaset ett dubbelsträngat brott i DNA:t (ofta med en förskjutning av flera nukleotider mellan strängarna), medan den biologiska rollen för DNA-molekylen kränks. I det fall då endast en av DNA-strängarna är metylerad sker ingen klyvning, istället lägger metyltransferas till metylgrupper till nukleotiderna i den andra strängen. Denna specificitet hos SR-M tillåter bakterier att selektivt klyva främmande DNA utan att påverka sitt eget. Normalt är allt DNA i en bakteriecell antingen helt metylerat eller helt metylerat längs endast en sträng (omedelbart efter replikering ). Däremot metyleras inte främmande DNA och genomgår hydrolys. [ett]
Restriktionsmodifieringssystem upptäcktes som ett resultat av att studera de molekylära mekanismerna för ett fenomen som kallas värdkontrollerad restriktion . Kärnan i fenomenet ligger i det faktum att bakteriofager isolerade från cellerna i en bakteriestam förökar sig mycket dåligt i en annan. När de infekteras med virala partiklar isolerade från den andra stammen upplever cellerna i den första återigen undertryckande av fagreproduktion, medan de i den andra stammen reproducerar sig normalt. I bakterier observeras således ett system för att undertrycka reproduktionen av bakteriofager. Virus som fortfarande lyckades övervinna det blir resistenta mot detta systems verkan. S. Luria och ML Human skrev i sin artikel från 1952 [2] :
Genom att analysera förhållandet mellan vissa fager och vissa mutanter av deras värdbakterier, stötte vi på ett nytt fenomen: genotypen av värden där viruset replikerar påverkar fenotypen av nya virus. Fenotypiska förändringar hämmar virusets förmåga att replikera i vissa stammar. Detta är en icke-permanent förändring, en framgångsrik cykel av reproduktion i en lämplig värd återställer viruset till sin ursprungliga form.
Originaltext (engelska)[ visaDölj] Vid analys av förhållandet mellan vissa fager och vissa mutanter av deras bakterievärdar har vi stött på en ny situation: genotypen av värden där ett virus reproducerar påverkar fenotypen av det nya viruset. Den fenotypiska förändringen undertrycker virusets förmåga att reproducera sig i vissa värdar men inte i andra. Det är en övergående förändring, i den meningen att en tillväxtcykel i en lämplig värd återställer viruset till sin ursprungliga form.Därefter visades det att bakteriofager isolerade från olika stammar har samma genotyp, men ett annat mönster av DNA-metylering, motsvarande specificiteten för CP-M av denna stam. [3]
1978 tilldelades Werner Arber , Daniel Nathans och Hamilton Smith Nobelpriset i fysiologi eller medicin "för deras upptäckt av restriktionsenzymer och deras tillämpning på molekylär genetik".
CP-M-enzymer är namngivna enligt det system som föreslogs 1973 av Smith och Nathans . [4] Namnet på ett enzym börjar med en akronym på tre bokstäver , där den första bokstaven är densamma som den första bokstaven i släktnamnet , och resten är de två första bokstäverna i arten där enzymet hittades . Förkortningen är skriven i kursiv stil. Ytterligare bokstäver används för att beteckna en viss stam eller serotyp . Romerska siffror tilldelas i den ordning i vilken enzymer av en given typ finns i en viss organism. Ytterligare bokstäver och siffror är inte kursiverade. Till exempel:
I tryckta källor finns det betydande skillnader i stavningen av namnen på samma enzymer (när det gäller kursiv stil och förekomsten av mellanslag). 2003 föreslog en stor grupp forskare att klassificeringen och nomenklaturen för restriktaser och metyltransferaser skulle systematiseras. [5] I synnerhet föreslås att man överger användningen av kursiv stil, hela namnet ska skrivas utan mellanslag. Det rekommenderas att namnen "restriktionsenzym" och "metylas" undviks, genom att använda "restriktionsendonukleas" och "metyltransferas" istället; typen av enzymatisk aktivitet indikeras med bokstäverna R (endonukleas) och M (metyltransferas) före akronymen - M.EcoRI och R.EcoRI.
Restriktionsendonukleaser introducerar avbrott i båda DNA-strängarna och delar upp det i två delar. Beroende på DNA-skärningens specificitet bildas produkter som har olika ändstrukturer (se figur).
Restriktionsmodifierande metyltransferaser lägger till metylgrupper till de kvävehaltiga baserna av DNA-nukleotidrester. Metylering kan ske vid N5- och N6-positioner i adenin , N4 och C5-i cytosin . Den enda givaren av metylgrupper för DNA-metyltransferaser är S-adenosin-L-metionin . I de flesta fall metyleras endast den andra strängen av semi-metylerat DNA, medan helt ometylerat DNA klyvs på grund av endonukleasaktiviteten hos CP-M.
Alla CP-M kräver Mg 2+ som en kofaktor. SR-M av den första och tredje typen behöver ATP och den fjärde i GTP . S-adenosylmetionin kan fungera inte bara som en donator av metylgrupper, utan också som en allosterisk regulator.
För närvarande särskiljs fyra typer av restriktionsmodifieringssystem , baserat på subenhetsstrukturen, substratspecificiteten, enzymets krav på kofaktorer och arten av DNA-klyvning [1] . [5] [6]
CRM av den första typen bildas av fem subenheter som fungerar som en helhet. Subenheter betecknas med förkortningen Hsd (värdspecificitetsdeterminant) och bokstaven som motsvarar funktionen (M -DNA-metyltransferas , R - restriktionsendonukleas , S-substratigenkänning). CP-M av den första typen är ett komplex av två HsdM, två HsdR och en HsdS. HsdR klyver fosfodiesterbindningar i DNA och har helikasaktivitet . HsdM producerar metylering av adeninrester i restriktionsställena vid den sjätte kväveatomen (m6A). HsdS ger igenkänning av vissa DNA-regioner, vilket bestämmer specificiteten för SR-M. [7]
När den verkar på ometylerat DNA dominerar nukleasaktivitet, de novo -metylering kan utföras med extremt låg effektivitet, vilket gör att bakteriofager kan övervinna verkan av CP-M och förvärva förmågan att föröka sig i en ny stam (för mer information, se ovan) ).
Restriktionsstället är en asymmetrisk tvådelad sekvens: 5'-sekvensen med 3-5 specifika nukleotider separeras av 6-8 nukleotider av vilken typ som helst från den 3'-specifika sekvensen med 4-5 baspar. Efter att ha identifierat målet, rör sig det enzymatiska komplexet längs DNA-molekylen och lindar upp den ( helikasaktivitet ), tills den stöter på ett hinder (till exempel ett annat protein). Således införs en brytning på ett stort godtyckligt avstånd (tusentals baspar) från restriktionsstället. [7] Klyvning av CP-M typ I-DNA kräver ATP -hydrolys . Detta beror på det faktum att energi krävs för att röra sig längs DNA-molekylen och varva ner den efter igenkänning av CP-M-stället. ATP utnyttjas med hjälp av den sk. DEAD-motorn [7] är en bevarad tvådomänstruktur som är karakteristisk för helikaser och vissa andra proteiner (till exempel den molekylära motorn för Sec-translokaset SecA). [åtta]
Denna typ är indelad i fyra familjer (IA-D) baserat på genetisk komplementering, DNA-hybridisering och immunkorsreaktivitet (korsreaktivitet med antikroppar ). [9]
I restriktionsmodifieringssystem av denna typ tillhandahålls metyltransferas- och nukleasaktiviteter i de flesta fall av oberoende proteiner. Endonukleaser skär DNA vid strikt definierade positioner inuti eller nära restriktionsstället, som ett resultat har DNA-ändarna vid brytstället 3'-hydroxylgrupper och 5'-fosfatgrupper. På grund av dessa egenskaper används endonukleaser av denna typ (särskilt IIP) i stor utsträckning inom genteknik . SR-M II kräver inte ATP eller andra energikällor för att fungera. Aktiva nukleaser kan existera som en monomer , homodimer eller homotetramer (för olika system). [5]
Metyltransferaser fungerar vanligtvis som en monomer. Metylering sker vid den fjärde (N) eller femte (C) positionen i cytosinresten , eller vid den sjätte (N) - adenin (för olika system har varje enskilt enzym strikt specificitet). [5]
Det finns flera undergrupper av typ II SR-M, vissa system kan tillhöra flera av dem samtidigt. [5]
Längden på en igenkänd palindrom är i de flesta fall 4, 6 eller 8 nukleotider. Klyvningen sker vid en fixerad position inom eller omedelbart intill restriktionsstället. Samtidigt orsakar olika enzymer bildandet av både klibbiga och trubbiga ändar.
Typ III SR-M inkluderar två subenheter (Res och Mod) som kombineras till en heterotetramer (Res 2 Mod 2 ) [7] med endonukleas- och metyltransferasaktiviteter. Res-subenheten har helikasaktivitet och kräver ATP - hydrolys för att fungera . [6] I motsats till typ 1 CP-M kräver DNA-hydrolys interaktion av två enzymkomplex. De känner igen två identiska restriktionsställen i motsatta riktningar. Ställen kan vara ometylerade eller enkelsträngsmetylerade. [7]
Mod-subenheten kan fungera separat från Res och fungera som ett metyltransferas (m6A). Samtidigt manifesteras nukleasaktiviteten hos Res-subenheten endast när den är i komplex med Mod. [5]
Typ IV SR-Ms klyver endast modifierat DNA som innehåller metylerade, hydroximetylerade eller glykosylhydroximetylerade baser. DNA-klyvning kräver hydrolys av GTP . Endonukleasaktivitet tillhandahålls av en enda polypeptid. Metyltransferasaktivitet saknas [10] . Nukleasaktivitet aktiveras allosteriskt av S-adenosylmetionin . Restriktionsstället är asymmetriskt och består av två åtskilda delar. DNA-skärning sker nära en av platserna. [6] [7]