DNA-hybridisering

DNA- hybridisering , nukleinsyrahybridisering - in vitro -kombination av komplementära enkelsträngade nukleinsyror till en molekyl. Med fullständig komplementaritet är kombinationen enkel och snabb, och vid partiell icke-komplementaritet saktar sammanslagningen av kedjor ner, vilket gör det möjligt att bedöma graden av komplementaritet. DNA-DNA och DNA-RNA-hybridisering är möjlig.

Experimentlogg

Det dubbelsträngade DNA :t värms upp i en lämplig buffert . På grund av förändringar i yttre förhållanden blir vätebindningar mellan komplementära kvävebaser termodynamiskt ogynnsamma och kedjorna divergerar.
Det denaturerade DNA-preparatet blandas med annat denaturerat DNA.
Preparaten kyls långsamt, medan enkelsträngat DNA hybridiserar med varandra (vätebindningar bildas mellan komplementära baser), medan en "hybrid" DNA-molekyl bildas.

Analys av hybridiseringshastigheten (=hybridisering) av enkelsträngat DNA gör det möjligt att utvärdera likheter och skillnader i DNA-sekvenser mellan arter eller individer av samma art.

Beräkning av smältpunkten för DNA

Den sekundära strukturen av DNA spelar en viktig roll inom biologi, genetisk diagnostik och andra metoder för molekylärbiologi och nanoteknik. Därför spelar den exakta bestämningen av smälttemperaturen för DNA- eller RNA- molekyler en mycket viktig roll i alla molekylärbiologiska metoder, till exempel vid valet av prover eller oligonukleotider för mikroarrayer eller vid valet av primrar för PCR . Det finns flera enkla formler för att beräkna smältpunkten för korta oligonukleotider. En grov beräkning av smälttemperaturen (Tm ) för en kort oligonukleotid (<20 nukleotider ) utförs genom direkt räkning av antalet nukleotider (G + C är summan av alla guaniner och cytosiner , L är längden av oligonukleotid):

$T_{m}=2(L+G+C)$ , [1]

Medelformeln för att beräkna Tm för en kort oligonukleotid (och för långa DNA-fragment) med hänsyn till koncentrationen av K + -joner och DMSO :

$T_{m}=77.1+11.7\lg[K^{+}]+{\frac {41(G+C)-528}{L))-0.75[\%DMSO]$ , [2]

Dessa ekvationer tar dock inte hänsyn till bindningsinitieringen under oligonukleotidhybridisering, tar inte hänsyn till egenskaperna hos själva sekvensen och sluteffekten som är karakteristisk för oligonukleotidduplex. Därför är denna formel mer lämplig där DNA-sekvensen är medelvärde och längden på duplexen är över 40 nukleotider.

Termodynamik av DNA

Den vanligaste metoden som används idag för att beräkna smälttemperaturen för dubbelsträngat eller enkelsträngat DNA är baserad på en tvåstegs termodynamisk modell. Två komplementära DNA-molekyler A och B är antingen bundna till varandra eller fria i lösning ("random coil state"). Det antas vanligtvis att molekylerna A och B är helt komplementära, så deras hybridisering är uppenbar, och ett eller flera komplementaritetsfel i duplexet är tillåtna, inklusive icke-komplementära par GG, GT och GA ( wobble pairs ). I fallet med endast en molekyl antas den vara packad i en loopstruktur. Processen för hybridisering till duplex beskrivs med formeln:

$A+B\longleftrightarrow AB$

där A och B är olika kedjor i lösning ("random coil state"), och AB är den bildade duplexen. Denna reaktion är reversibel. Jämviktskonstanten kför denna reaktion definieras som: . $k={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

Jämviktskonstanten beror på kedjekoncentrationen, temperaturen, saltkoncentrationen, pH och andra komponenter i reaktionen (t.ex. glycerol eller DMSO ). Konstanten k ändras som svar på en förändring i koncentrationen av en eller båda kedjorna ([At] och/eller [Bt]), sedan reagerar hela systemet på förändringar, och sedan de individuella koncentrationerna av [A], [B] och [AB] kommer också att ändras. Till exempel, om det finns mer kedja A i systemet, kommer koncentrationen av [AB] att öka. Antag att jämviktskonstanten är 1,81×10 6 och koncentrationen av kedjor är [At] = [Bt] = 10 −5 M:

$k=1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$[At]=10^{-5}M=[A]+[AB]$

$[Bt]=10^{-5}M=[B]+[AB]$

Vi ersätter komponenterna i formlerna för beräkning k:

$k={\frac {[AB]}{([A]-[AB])([Bt]-[AB]))))$

$k=1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{(10^{-5}-[AB])(10^{-5}-[AB])))$

Efter omarrangering får vi:

$O=k[AB]^{2}-{\frac {k[At]+k[Bt]+1}{[AB]+k[At][Bt]}}$

$O=aX^{2}+bX+c$

var . $[AB]=X={\frac {\pm b{\sqrt {(}}b^{2}-4ac)}{2a}}$

Till exempel, när [AB] = 7,91x10 −6 M ersätts i denna formel, kommer koncentrationen av kedjor att vara [A] = [B] = 2,09x10 −6 M. Det vill säga endast 79 % av kedjorna [At] ] kommer att anslutas i duplexet [AB ].

Är det möjligt att bestämma jämviktskonstanterna med en temperaturförändring? Detta för oss till förståelsen av viktiga termodynamiska parametrar som fri energi (dG), entalpi (dH) och entropi (dS). Förändringar i fri energi, entalpi och entropi sker under övergången från "hybridiseringstemperaturen T" till ett oordnat, slumpmässigt tillstånd. Dessa samband definieras av formeln dG = dH – TdS, (för kedjekoncentration [A] = [B] = [AB] = 1M), då är den idealiska formeln för att beräkna Gibbs fria energi:

$dG_{T}^{0}={\frac {dH^{0}-TdS^{0}}{1000}}$

där Ttemperaturen är i Kelvin, dH° (cal/mol) och dS° (cal/mol K).

Det finns ett användbart samband som relaterar förändringen i Gibbs fria energi under en kemisk reaktion till dess jämviktskonstant:

$dG_{T}^{0}=-RT\cdot \ln(k)$

där R är den universella gaskonstanten (1,987 cal/mol K).

Genom att kombinera båda formlerna får vi:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}-R\ln(k)))$

Smälttemperaturen (T m ) bestäms vid jämvikt, när hälften av kedjorna är anslutna till varandra och den andra hälften är i fritt tillstånd, det vill säga k=1:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}-273.15$

Smältpunkten för en enkel slinga beräknas som . För en DNA-duplex är det nödvändigt att ta hänsyn till koncentrationen av varje sträng (i mol, M). Således, om [A] och [B] är koncentrationerna av molekylerna A och B, så är den totala koncentrationen av kedjor, C, lika med deras summa, [A] + [B]. $T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}$

Det antas att koncentrationen av båda kedjorna är densamma [A] = [B] = C/2. I detta fall

$T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\cdot \ln({\frac {C}{f}})))$

där f = 4. För en självkomplementär oligonukleotid [A 0 ] = C, och sedan f = 1. Denna smältpunkt bestäms först när hälften av molekylerna är bundna till varandra.

För en självkomplementär oligonukleotid k = 1/[At] därför:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At])))-273.15$

För en icke-komplementär duplex, när [At] ≥ [Bt], k = 1/([At] - [Bt]/2), beräknas Tm enligt följande:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At]-{\frac {[Bt]}{2))))}-273,15$

där [At] är den molära koncentrationen av den dominanta strängen (vanligtvis PCR-primern) och [Bt] är den molära koncentrationen av den lågkoncentrationssträngen (genomiskt DNA).

Beräkning av smältpunkten

Inkrementen ΔG, ΔH och ΔS för de termodynamiska parametrarna G, H och S beräknas baserat på den närmaste grannmodellen. Noggrann förutsägelse av den sekundära strukturen av DNA under hybridisering med hjälp av dynamiska programmeringsalgoritmer kräver en databas med alla möjliga termodynamiska parametrar för varje komplementärt baspar, såväl som för alla varianter vid nukleotidfelmatchningar, för fria ändar, hårnålar och slingor. Den termodynamiska formeln för att beräkna en kort oligonukleotid är baserad på termodynamiska parametrar - entropi S och entalpi H, för var och en av de 10 kombinationerna av fyra nukleotider (tabell 1). Tabell 1 visar de termodynamiska parametrarna för närmaste grannar (NN) för nukleotidpar vid en koncentration av 1 M NaCl.

För att beräkna Tm (°С) summeras alla Gibbs fria energivärden för varje par i steg om en nukleotid:

ΔG totalt = ΔG initial + ΔG symmetri + ∑ΔG + ΔG AT slutet

5'-CGTTGA-3'	= ΔG initial + ΔG symmetri +	CG+GT+TT+TG+GA+AT slutet
3'-GCAACT-5'		GC CA AA AC CT

ΔG teoretisk = 1,96 + 0 - 2,17 - 1,44 - 1,44 - 1,00 - 1,45 - 1,30 +0,05

ΔG teoretisk = -5,35 kcal/mol

Entropiökningar (ΔH = -43,5 kcal/mol) och entalpi (ΔS = -122,5) beräknas på liknande sätt:

$T_{m}={\frac {-43.5\cdot 1000}{-122.5+1.9872\ln({\frac {0.0004}{4))))}-273.15=35.8$

Många DNA-duplex har konkurrerande enkelsträngsstrukturer. Detta förskjuter systemets jämvikt, och som ett resultat blir värdet på T m mindre än värdet som förutsägs av formeln.

Den allmänna formeln för att beräkna T m med korrigering för salt i lösning är:

$T_{m}={\frac {\Delta H\cdot 1000}{dS+R\ln({\frac {C}{4)))+0,386(L-1)\ln([K^ {+}])}}-273,15$

där L är oligonukleotidens längd, R är gaskonstanten (1,987 cal/K mol), c är koncentrationen av oligonukleotiden i (vanligtvis 2x10 −7 M), [K + ] är koncentrationen av kaliumjoner i mol (vanligtvis 5x10 −2 M).

Tabell 1. Termodynamiska parametrar för närmaste grannar (NN) för nukleotidpar vid en koncentration av 1M NaCl [3] , [4]

Sekvens av par (5'-3'/3'-5')	$\Delta H$ ° kcal/mol	$\Delta S$ ° cal/(mol K)	$\Delta G$ ° 37 kcal/mol
AA/TT	-7,6	-21.3	-1.00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0,88
TA/AT	-7.2	-20.3	-0,58
CA/GT	-8,5	-22.7	-1.45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1,44
CT/GA	-7,8	-21.0	-1,28
GA/CT	-8.2	-22.2	-1.30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9,8	-24.4	-2.24
GG/CC	-8,0	-19.9	-1,84
initiering	+0,2	-5.7	+1,96
ändpar AT	+2.2	+6,9	+0,05
symmetrikorrigering	0,0	-1.4	+0,43

Enstaka fel i en duplex

Den närmaste grannmodellen för komplementära nukleotidpar kan utökas till par som inkluderar icke-komplementära nukleotider. Det har visat sig att det finns en trend att minska stabiliteten för icke-komplementära baspar i fallande ordning:

GC > AT > G G > G T ≥ G A > T T ≥ A A > T C ≥ A C ≥ C C

Guanidin G är den mest promiskuösa basen eftersom den bildar både de starkaste basparen och stabila par med icke-komplementära baser (G·G, G·T och G·A). Å andra sidan är cytosin C den mest diskriminerande basen eftersom den bildar de mest stabila komplementära paren och instabila par med icke-komplementära baser (T·C ≥ A·C ≥ C·C) [5] , [6] .

Se även

Anteckningar

↑ Wallace RB, Shaffer J., Murphy RF, Bonner J., Hirose T., Itakura K. Hybridisering av syntetiska oligodeoxiribonukleotider till phi chi 174-DNA: effekten av enstaka baspars felmatchning // Nucleic Acids Res : journal. - 1979. - Vol. 6 , nr. 11 . - P. 3543-3557 . doi : 10.1093 / nar/6.11.3543 .
↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonukleotidssmälttemperaturer under pcr-förhållanden: korrigeringar av närmaste granne för Mg 2+ , deoxinukleotidtrifosfat- och dimetylsulfoxidkoncentrationer med jämförelse med alternativa empiriska formler // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47 , nr. 11 . - P. 1956-1961 . Arkiverad från originalet den 1 september 2012.
↑ SantaLucia JJ, Hicks D. Termodynamiken i DNA-strukturmotiv // Årlig översyn av biofysik och biomolekylär struktur : tidskrift . - 2004. - Vol. 33 . - doi : 10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800 .
↑ SantaLucia JJ En enhetlig syn på polymer, hantel och oligonukleotid-DNA närmaste-granne termodynamik // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal . - 1998. - Vol. 95 , nr. 4 . - P. 1460-1465 . - doi : 10.1073/pnas.95.4.1460 . — PMID 9465037 .
↑ Peyret N., Seneviratne PA, Allawi HT, SantaLucia JJ Termodynamik för närmaste granne och NMR av DNA-sekvenser med interna AA-, CC-, GG- och TT-felmatchningar // Biokemi: journal. - 1999. - Vol. 38 . - P. 3468-3477 . - doi : 10.1021/bi9825091 .
↑ Allawi HT, SantaLucia JJ Termodynamik och NMR av interna GT-felmatchningar i DNA // Biochemistry: journal. - 1997. - Nej . 36 . - P. 10581-10594 . doi : 10.1021 / bi962590c .