Två-foton lasermikroskop - ett lasermikroskop som låter dig observera levande vävnader på ett djup av mer än en millimeter, med hjälp av fenomenet fluorescens . Ett tvåfotonmikroskop är en typ av multifotonfluorescensmikroskop . Dess fördelar jämfört med ett konfokalt mikroskop är dess höga penetreringsförmåga och låga fototoxicitet [1] .
Tvåfotonmikroskopet konstruerades först av Winfred Denk i W. W. Webbs laboratorium vid Cornell University [2] . Han kombinerade idén om två-foton excitation med laserskanning.
Tvåfotonlasermikroskopet är baserat på den fysikaliska princip som Maria Goeppert-Mayer beskrev i sin doktorsavhandling [3] 1931.
Processen med tvåfotonexcitation sker enligt följande: två lågenergifotoner exciterar en fluorofor (en molekyl eller del av en molekyl som kan fluorescensera) under en kvanthändelse. Resultatet av denna excitation är den efterföljande emissionen av en fluorescerande foton från de exciterade molekylerna. Energin hos den fluorescerande fotonen är större än energin hos de exciterande fotonerna.
Sannolikheten att båda excitationsfotonerna kommer att absorberas av en molekyl är mycket liten. Därför krävs ett stort flöde av exciterande fotoner, vilket kan erhållas med hjälp av laserutsändande fotoner med hög pulsrepetitionshastighet (80 MHz). De vanligast använda fluoroforerna har ett excitationsspektrum i intervallet 400-500 nm, medan excitationslaservåglängden är i intervallet 700-1000 nm (infrarött område). Om fluoroforen absorberar två fotoner samtidigt, kommer den att få tillräckligt med energi för att gå in i ett exciterat tillstånd. Därefter kommer den exciterade fluoroforen att emittera en foton (i den synliga delen av spektrumet), vars våglängd beror på typen av fluorofor.
Eftersom absorptionen av två fotoner är nödvändig för att fluoroforen ska gå in i det exciterade tillståndet, är sannolikheten för att fluoroforen emitterar en sekundär foton proportionell mot kvadraten på excitationsintensiteten. Därför blir fluorescensen starkare när laserstrålen är tydligt fokuserad och inte spridd. Den maximala fluorescensen observeras i fokalvolymen (volymen där laserstrålen är fokuserad) och visar en kraftig minskning i området utanför fokus.
I ett tvåfotonmikroskop fokuseras en infraröd laserstråle med hjälp av en konvergerande objektivlins . Vanligtvis används en högfrekvent 80 MHz safirlaser, som avger en 100 femtosekundspuls som ger den höga fotonflödestätheten som krävs för tvåfotonabsorption.
Ljuset som emitteras från ett fluorescerande prov förstärks med hjälp av ett mycket känsligt fotomultiplikatorrör . Eftersom ljusmottagaren är enkanalig bildar ljusintensiteten som observeras i en given fokalvolym en bildpixel . För att erhålla en tvådimensionell pixelbild utförs skanning i provets fokalplan .
Användningen av infrarött ljus för att excitera fluoroforen i de studerade vävnaderna har sina fördelar [4] :
Men det finns också några nackdelar: