Immunfällning är en metod för att isolera ett protein från komplexa blandningar såsom cellysat , sera och vävnadshomogenat med hjälp av proteinspecifika antikroppar . Immunfällning gör det möjligt att detektera förändringar i proteinuttryck , att karakterisera proteiner med vilka det studerade proteinet bildar ett komplex, att identifiera proteinbindningsställen med nukleinsyror [1] .
När man utför immunfällning binder antikroppar till mikropärlor. De mest använda mikropärlorna är gjorda av agaros . Mikropärlor med magnetiska egenskaper kan också användas. Med hjälp av en magnet kan magnetiska mikropärlor som bär antigen-antikroppskomplex förvaras i provröret medan provkomponenterna som inte har bundits till antikroppen tas bort från det [1] .
Beroende på metoden för antikroppsbindning på mikropärlor finns det tre immunoutfällningsteknologier. Den klassiska tekniken använder mikropärlor belagda med protein A eller protein G. Protein A, liksom protein G, kan binda till Fc- regionen av en mängd olika antikroppar. En antikropp specifik för proteinet som ska isoleras inkuberas med blandningen från vilken proteinet ska isoleras. Efter att komplexet av det utsöndrade proteinet ( antigenet ) med antikroppen har bildats, införs i blandningen mikropärlor belagda med protein A eller protein G. Antigen-antikroppskomplexen binder på mikropärlorna. Med hjälp av centrifugering och tvättning separeras mikropärlor med tillhörande antigen-antikroppskomplex från blandningen. Antigen och antikropp elueras från mikropärlorna. Ibland tillsätts mikropärlor till blandningen som antikropparna tidigare har bundits till. Den största nackdelen med den klassiska teknologin är att elueringen av det isolerade proteinet från mikropartikeln också kommer att avlägsna antikroppen från mikropartikeln. Som ett resultat kommer det isolerade proteinet att kontamineras och antikropparna kan inte återanvändas [1] .
Kontaminering av det isolerade proteinet och förlust av antikroppar kan undvikas genom att immobilisera antikropparna på mikropartikeln. Det finns två teknologier: immobilisering på grund av kovalent tvärbindning av antikroppen och protein A eller protein G beläget på ytan av mikropartikeln, och immobilisering på grund av bildandet av en kovalent bindning mellan antikroppen och materialet i mikropartikeln. Dessa tekniker har också sina nackdelar. En nackdel med att kovalent länka en antikropp till protein A eller protein G är att tvärbindningsreagenset kan bilda kovalenta bindningar på godtyckliga ställen på antikroppen, vilket skadar det aktiva stället , och som ett resultat förlorar antikroppen sin förmåga att binda antigenet. Nackdelen med att kovalent länka antikroppen och mikropartikelmaterialet är att, till skillnad från med protein A- eller protein G-teknologier, kommer en godtycklig region av antikroppen att binda till mikropartikeln, vilket kan leda till förlust av antikroppens förmåga att binda antigenet. [1] .
I en situation där antikroppar mot ett isolerat protein inte är tillgängliga, kan en tagg sys fast på den med hjälp av genteknikmetoder (till exempel en FLAG-tagg ), mot vilken antikroppar finns tillgängliga [2] .
Fördelarna med immunoutfällning inkluderar det faktum att antigener i denna metod interagerar med antikroppar i sin naturliga konformation för ytterligare separation och kvantitativ analys. Dessutom låter metoden för immunfällning dig koncentrera proteinet. Nackdelen med metoden är att för effektiv detektion måste proteinet vara radioaktivt märkt [3] .
Co-immunoprecipitation (Co-IP) är immunoutfällning av ett helt proteinkomplex , som baseras på användningen av en antikropp som är specifik för ett av proteinerna som utgör komplexet. Genom att binda detta protein binder antikroppen hela komplexet. Som ett resultat blir det möjligt att identifiera alla proteiner som utgör komplexet [1] .
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) är en metod för att hitta bindningsställen för det studerade DNA-bindande proteinet i genomet . För att göra dettaisoleras DNA från cellen och skärs i små fragment, och sedan utförs immunoutfällning med hjälp av antikroppar mot det studerade DNA-bindande proteinet. Som ett resultat binder komplex bestående av det studerade DNA-bindande proteinet och ett DNA- fragment till antikroppar . Sådana DNA-fragment är bindningsställena för det studerade DNA-bindande proteinet i genomet. För att läsa nukleotidsekvensen för dessa DNA-fragment används DNA-mikroarrayer (ChIP-on-chip) eller moderna sekvenseringsmetoder (ChIP-seq) [4] [5] .
RNA- immunfällning (RIP) är en metod som låter dig identifiera RNA-molekyler som interagerar med det RNA-bindande proteinet som studeras och bestämma bindningsställena för det studerade proteinet med RNA-molekyler. Proceduren för RNA-immunfällning liknar kromatin -immunfällning . För att läsa nukleotidsekvensen för de isolerade RNA-fragmenten används DNA-mikroarrayer, som tidigare har erhållit DNA-molekyler som är komplementära till de utvalda fragmenten (RIP-chip), eller moderna sekvenseringsmetoder (RIP-seq) [6] .