Ziehl-Nielsen-färgningsmetoden (enligt Ziehl-Nelsen [1] ) är en färgningsmetod för mikroorganismer för att upptäcka syraresistenta mykobakterier (orsakande medel för tuberkulos , mykobakterios , spetälska ), aktinomyceter och andra syraresistenta mikroorganismer . Syraresistensen hos mikroorganismer beror på närvaron av lipider , vaxer och hydroxisyror i deras celler . Sådana mikroorganismer färgas dåligt med utspädda färglösningar. För att underlätta inträngningen av färgämnet in i mikroorganismernas celler, värms Tsilya - karbolfuchsinet som appliceras på beredningen över en brännarlåga. Färgade mikroorganismer missfärgas inte av svaga lösningar av mineralsyror och alkohol.
Metoden är uppkallad efter tyska läkare - mikrobiologen Franz Ziel och patologen Friedrich Nelsen ( Nielsen), som utvecklade den 1882-1883 .
lös 0,3 g metylenblått klorid i 100 ml destillerat vatten.
När de färgas med denna metod blir syraresistenta bakterier intensivt röda , resten av mikrofloran färgas ljusblått [3] .
Syraresistent Mycobacterium tuberculosis är cirka 1-10 mikron lång och 0,2-0,6 mikron bred. Vanligtvis ses de i form av tunna graciösa pinnar, men ibland kan du hitta böjda eller vridna alternativ. Vid färgning med karbolfuchsin detekteras mycobacterium tuberculosis som tunna, lätt böjda hallonröda stavar som innehåller ett varierande antal granulat. Mikroorganismer, lokaliserade ensamma, i par eller i grupper, sticker ut väl mot den blå bakgrunden av andra komponenter i läkemedlet. Det är inte ovanligt att bakterieceller bildar en romersk siffra "V".
Inom individuella mikrobiella celler kan områden med mer intensiv färgning hittas, vilket resulterar i ett "pärlaktigt" utseende, medan svagare färgningsområden kan ses som "ränder". I beredningen kan även förändrade koccliknande syraresistenta former av patogenen, rundade sfäriska eller mycelliknande strukturer detekteras. Vid upptäckt av förändrade former av syraresistenta mikroorganismer måste dock ett positivt svar bekräftas av ytterligare forskningsmetoder.
Vissa andra mikroorganismer, som inte är relaterade till M.tuberculosis , kan ha olika former - från långa pinnar till coccoidformer med varierande färgningsintensitet. Olika grader av syrafast färgning kan observeras inte bara hos mykobakterier utan även hos andra mikroorganismer. Dessa kan vara Rhodococcus , Nocardia, Legionella , såväl som cystor av Cryptosporidium och Isospora . Snabbväxande mykobakterier kan skilja sig åt i graden av syrafast färg - med en partiell förlust av syrafast färg får de en lila-röd färg.
I en kulturstudie ges svaret om isolering av syrafasta mykobakterier först efter mikroskopering av ett Ziehl-Neelsen-färgat utstryk från uppvuxna kolonier. När man förbereder utstryk för mikroskopisk undersökning visar kolonier av Mycobacterium tuberculosis sina fysiska och kemiska egenskaper: de emulgerar inte i en isoton lösning, utan bildar en granulär, smulig suspension. Detta beror på närvaron i sammansättningen av deras cellvägg av ett stort antal hydrofoba fettvaxämnen. Mikroskopisk undersökning av utstryk från uppvuxna kolonier, färgade enligt Ziehl-Nelsen, avslöjar ljusa karmosinröda stavformade bakterier som ligger ensamma eller i grupp och bildar kluster eller väver i form av "filt" eller "flätor". Tuberkulosmykobakterier ser ut som tunna, raka eller lätt böjda pinnar 1–10 (vanligtvis 1–4) µm långa, 0,2–0,6 µm breda, homogena eller granulära med lätt rundade ändar. Oftare i beredningen, särskilt i långväxande kulturer, är ansamlingar av mörkfärgade korn synliga. I unga kulturer, särskilt isolerade från patienter som behandlats under lång tid med anti-tuberkulosläkemedel, kännetecknas mykobakterier av hög polymorfism, upp till uppkomsten av korta, nästan koccoida former.
Mikroskopisk undersökning av ett utstryk bör undersöka minst 100 synfält för att kvantifiera läkemedlet och upptäcka enstaka mykobakterier. I händelse av att resultatet av en sådan studie visar sig vara negativt, granskas ytterligare 200 synfält för bekräftelse. Med ett betydande antal syraresistenta mykobakterier räcker det att undersöka 20-50 synfält både med Ziehl-Neelsen-färgning och med fluorescerande mikroskopi (se tabell ). Under mikroskopisk undersökning av preparatet är det nödvändigt att vara säker på att inget synfält av preparatet ses upprepade gånger, därför rekommenderas att alltid se preparatet enligt samma schema:
De börjar se preparatet från det övre vänstra synfältet som valts i smeten, och rör sig gradvis antingen längs preparatets längdaxel till slutet av smeten, eller rör sig ner och sedan stiger upp igen, etc., passerar genom alla synfält till utstrykets kant. Med en mikroskopförstoring på 1000x, det vill säga 100x för ett oljenedsänkningsobjektiv och 10x för ett okular, när man undersöker en slaglängd (~ 20 mm), betraktas cirka 100-120 synfält i en longitudinell passage (fältdiameter - 0,16 - 0, 2 mm).
| Forskningsresultat | Minsta antal synfält (p/s) | Blankett för resultatprotokoll | Tolkning av studieresultat |
|---|---|---|---|
| AFB [4] inte upptäckt i 300 p/s | 300 | OTR. | Negativ |
| 1 - 2 KUM på 300 p/s | 300 | Det rekommenderas att göra om studien | Resultatet utvärderas inte |
| 1 - 9 KUM på 100 p/s | 100 | "_N__" KUM på 100 p/s [5] | Positiv |
| 10 - 99 KUM på 100 p/s | 100 | 1+ [6] | Positiv |
| 1 - 10 KUM på 1 p/s | femtio | 2+ [6] | Positiv |
| Mer än 10 KUM på 1 p/s | tjugo | 3+ [6] | Positiv |