Klorofyllfluorescens

Klorofyllfluorescens är fenomenet med klorofylls luminescens när det absorberar ljus, uppstår som ett resultat av molekylens återgång från det exciterade tillståndet till grundtillståndet. Det används ofta som en indikator på fotosyntetisk energiomvandling i högre växter , alger och bakterier . Exciterad klorofyll förlorar den absorberade ljusenergin, slösar bort den på fotosyntes (fotokemisk energiomvandling eller fotokemisk släckning), omvandlar den till värme som ett resultat av icke-fotokemisk släckning , eller avger den i form av fluorescens. Eftersom alla dessa processer konkurrerar med varandra kan man genom att analysera klorofyllfluorescensen få en uppfattning om intensiteten i fotosyntesen och växtens hälsa [1] .

Kautsky-effekten

Efter belysning av mörkanpassade löv kan en snabb ökning av Photosystem II (PSII) fluorescens observeras följt av en långsam minskning. Detta fenomen beskrevs första gången av H. Kautsky och A. Hirsch 1931. Effekten kallades Kautsky-effekten efter dess upptäckare.

Ökningen av fluorescens beror på det faktum att reaktionscentra i fotosystem II (PSII) går in i ett "stängt" tillstånd. Ett reaktionscentrum sägs vara "stängt" när det inte längre kan överföra elektroner. Detta inträffar när uppströms elektronbäraren har återställts och ännu inte har överfört sina elektroner till nästa elektronacceptor. Stängningen av reaktionscentra minskar den totala effektiviteten av fotokemiska reaktioner (kP) och ökar därför nivån av fluorescens (kF). Den plötsliga överföringen av bladet från mörkt tillstånd till ljust ökar andelen slutna PSII-reaktionscentra och leder till en ökning av fluorescens under de första 1-2 sekunderna. Senare försvagas fluorescensen långsamt, denna process kan pågå i flera minuter. Nedgången beror på aktiveringen av "fotokemisk släckning" och överföringen av elektroner från PSII genom ETC av kloroplaster till NADP och kolfixeringscykeln, samt inkluderingen av icke-fotokemiska släckningsmekanismer , som omvandlar excitationsenergi till värme .

Fluorescensmätningar

Mätningar börjar med att bestämma bakgrundsnivån av fluorescens , som mäts genom att utsätta bladet för en kort blixt av lågintensitetsljus (för PAM-enheter), otillräcklig för att orsaka en fotokemisk reaktion (alla reaktionscentra är öppna), och leder därför helt till fluorescens [2] . $F_{0}$

För att använda mätningen av klorofyllfluorescens för att analysera fotosyntes måste forskarna skilja mellan fotokemisk släckning och icke-fotokemisk släckning (värmegenerering). Detta uppnås genom att stoppa fotokemiska reaktioner, vilket gör det möjligt för forskare att mäta fluorescens i närvaro av enbart icke-fotokemisk släckning. För att göra detta är växten skarpt upplyst med en stark ljusblixt eller förs in i ljuset efter mörkeranpassning. Det finns en tillfällig stängning av alla PSII-reaktionscentra och energi överförs inte längs elektronbärarkedjan. Icke-fotokemisk släckning har ingen effekt om blixten är tillräckligt kort. Under en blixt (eller efter en plötslig exponering av växten för ljus från mörker) är reaktionscentra mättade med ljus med en övergång till ett stängt tillstånd. Under sådana förhållanden, när det inte finns någon fotokemisk släckning, och inte fotokemisk släckning är försumbart liten, når fluorescensen sin maximala nivå, betecknad som fluorescensmaximum [2] . $F_{m}$

Effektiviteten av fotokemisk släckning, som bestämmer effektiviteten av PSII, kan bedömas genom att jämföra med den stationära nivån av fluorescens i ljuset och bakgrundsnivån av fluorescens i frånvaro av ljus lämpligt för fotosyntes. Effektiviteten av icke-fotokemisk härdning varierar beroende på olika interna och externa faktorer. Dess förstärkning leder till en ökning av värmeavgivningen och en minskning av . Eftersom det är omöjligt att helt stoppa värmeenergiförlusten är det omöjligt att mäta klorofyllfluorescens i fullständig frånvaro av icke-fotokemisk släckning. Därför använder forskare den mörka anpassningspunkten ( ) med vilken de jämför det beräknade värdet av icke-fotokemisk härdning [2] . $F_{m}$ $Med$ $F_{0}$ $F_{m}$ $F_{m}^{0}$

Allmänna fluorescensparametrar

$F_{0}$ : Minsta fluorescens (i relativa enheter). Fluorescensnivå under förhållanden där alla reaktionscentra antas vara öppna (mörkadaptation).

$F_{m}$ : Maximal fluorescens (i relativa enheter). Fluorescensnivå vid blixtar med hög intensitet. Alla reaktionscentra anses vara stängda.

${F_{0))'$ : Minsta fluorescens (i relativa enheter) under ljusanpassningsförhållanden. Fluorescensnivån för det bestrålade provet, som är reducerad jämfört med på grund av närvaron av icke-fotokemisk släckning. $F_{0}$

${F_{m))'$ : Maximal fluorescens (i relativa enheter) under ljusanpassningsförhållanden. Fluorescensnivå för ett prov bestrålat med mättande ljuspulser som tillfälligt täcker alla PSII-reaktionscentra.

${\displaystyle F_{tr))$ : Terminal fluorescens (i relativa enheter). Släckning av fluorescens vid slutet av testet.

$T_{{1/2}}$ : Hälften av stigtiden från till . $F_{0}$ $F_{m}$

Designparametrar

${\displaystyle F_{v))$ : Variabel fluorescens. Beräknat som = - [3] . ${\displaystyle F_{v))$ $F_{m}$ $F_{0}$

${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ : Förhållandet mellan variabel fluorescens och maximal fluorescens. Beräknat som . [4] . Det är ett mått på den maximala effektiviteten av PSII (om alla centra var öppna). kan användas för att bedöma den potentiella effekten av PSII när prover mäts under mörka anpassningsförhållanden. ${\displaystyle {\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m))))$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

$qP$ : Fotokemisk släckning. denna parameter ger en grov uppskattning av andelen öppna PSII-reaktionscentra. Beräknat som [5] . ${\frac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ : Effektiviteten av fotokemiska reaktioner av fotosystem II. Beräknat som = [6] . Denna parameter indikerar andelen ljus absorberat av PSII som användes i fotokemiska reaktioner. Som sådan kan den ge ett mått på hastigheten för linjär elektrontransport och kännetecknar därför all fotosyntes som helhet. $Y_{(II)}$ ${\tfrac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ ger en uppskattning av effektiviteten av fotosyntes , och berättar vilka processer som påverkar effektiviteten. Stängning av reaktionscentra till följd av hög ljusintensitet kommer att ändra värdet . Förändringar i effektiviteten av icke-fotokemisk härdning kommer att ändra förhållandet . $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

Praktisk användning

Fotosystem II effektivitet som ett mått på fotosyntes

Klorofyllfluorescens används för att mäta nivån av fotosyntes, men i dess kärna är detta en alltför förenkling. Fluorescens kan användas för att mäta effektiviteten av PSII-fotokemi, som kan användas för att uppskatta hastigheten för linjär elektrontransport genom att multiplicera med ljusintensitet. Men när forskare säger "fotosyntes" menar de vanligtvis kolfixering . Elektrontransport och CO 2 -fixering har en ganska bra korrelation, men detta kanske inte observeras i fält på grund av konkurrerande processer som fotorespiration , kvävemetabolism och Mehler-reaktionen .

Samband mellan elektrontransport och koldioxidfixering

Att mäta klorofyllfluorescens och gasutbyte samtidigt för att få en helhetsbild av hur växter reagerar på sin miljö kräver en seriös och sofistikerad forskningsteknik. En metod är att samtidigt mäta CO 2 - fixering och PSII fotokemiska reaktioner vid olika ljusintensiteter under förhållanden som undertrycker fotorespiration . Grafer över CO 2 - fixering och PSII fotokemiska reaktioner gör det möjligt att beräkna antalet elektroner som krävs för assimilering av en CO 2 - molekyl . Baserat på denna bedömning är det möjligt att uppskatta nivån av fotorespiration . Denna metod används för att undersöka betydelsen av fotorespiration som en fotoskyddande mekanism under torka.

Sobradu (2008) [7] studerade gasutbyte och klorofyllfluorescens som svar på hög ljusintensitet hos pionjär- och skogsarter. Vid middagstid mättes gasutbytet av löv med mätning av den totala nivån av fotosyntes och den intercellulära koncentrationen av CO 2 ( ). I samma blad mättes klorofyllfluorescensparametrar (bakgrund ; maximum ; och variabel ) . Resultaten visade att, trots att pionjärarter och skogsarter härstammar från olika livsmiljöer, visade båda liknande känslighet för fotoinhibering vid middagstid . $C_{i}$ $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{v))$

Mätning av stressnivåer och motståndskraft

Klorofyllfluorescens gör det möjligt att mäta växternas stressnivå. Utifrån dess nivå kan man bedöma exponeringsnivån för abiotiska påfrestningar, eftersom extrema temperaturer, överdriven belysning och torka påverkar växternas ämnesomsättning negativt. Detta leder i sin tur till en obalans mellan absorptionen av ljusenergi av klorofyll och användningen av denna energi i fotosyntesprocessen [8] .

Favaretto et al. (2010) [9] studerade hög ljusanpassning hos pionjärarter och sena successionsarter som odlats under förhållanden med 100 % (sol) och 10 % (skugga) av normalt ljus. Nedgången i fullt ljus visade sig vara större hos sena successionsarter än hos pionjärarter. Sammantaget indikerar dessa resultat att pionjärarter växer bättre i fullt ljus än sena successionsarter, vilket tyder på att de har en hög tolerans mot fotooxidativ skada. ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$
Neocleous och Vasilakakis (2009) [3] undersökte hallonens reaktion på bor- och saltstress . Med hjälp av en fluorometer mätte de , och . Bladklorofyllfluorescens var inte signifikant beroende av NaCl-koncentrationen när borkoncentrationen var låg. När borkoncentrationen ökades minskade klorofyllfluorescensen i bladen under samma salthaltsförhållanden. Man kan dra slutsatsen att den kombinerade effekten av bor och NaCl på hallon orsakar en toxisk effekt som påverkar fotokemiska parametrar. $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{v))$

Kvävebalansindex

Med tanke på förhållandet mellan klorofyll och kvävehalt i löv kan klorofyllhalt användas för att upptäcka kvävebrist hos växter. Det finns flera olika metoder för detta.

Det visade sig att det är möjligt att bedöma växternas kvävemetabolism efter nivån av polyfenoler . När växten är i optimala förhållanden främjar den normal metabolism och syntesen av proteiner (huvudformen av biologiskt kväve), klorofyller och en liten mängd flavonoider (sekundära metaboliter). Å andra sidan, vid kvävebrist sker en ökad produktion av flavonoider [10] .

Kvävebalansindexet låter dig utvärdera kvävehalten under naturliga förhållanden genom att beräkna förhållandet mellan klorofyll och flavonoider.

Mätning av klorofyllhalt

Gitelson (1999) postulerade: "Släktskapet mellan klorofyllfluorescens vid 735 nm och i våglängdsområdet från 700 nm till 710 nm är linjärt relaterat till klorofyllhalten (med en bestämningskoefficient r2 större än 0,95) och kan därför användas som en noggrann indikator på klorofyllinnehåll i växtblad. [elva]

Fluorometrar

Utvecklingen av fluorometrar har gjort mätning av klorofyllfluorescens till en vanlig metod inom växtfysiologi. En revolution i analysen av klorofyllfluorescens gjordes genom uppfinningen av pulsamplitudmodulationstekniken (PAM) [ 12 ] [ 13] och uppkomsten av den första kommersiella pulsfluorimetern eller PAM-fluorimetern PAM-101 (Walz, Tyskland ). Genom att modulera amplituden för mätljusstrålen (mikrosekundpulsintervall) och parallellt detektera den exciterade fluorescensen är det möjligt att bestämma det relativa fluorescensutbytet (Ft) i närvaro av spritt ljus. I grunden betyder detta att klorofyllfluorescens kan mätas i fält även under direkt solljus [2] .

Vissa blixtfluorometrar kan bestämma både ljusparametrar och mörkeranpassningsparametrar (F o , F m , F o ', F m ', F v /F m , Y, F t , F oq ) och kan beräkna fotokemiska släckningskoefficienter. och icke -fotokemisk släckning (qP, qL, qN, Y(NO), Y(NPQ) och NPQ). Vissa fluorometrar är helt bärbara och manövreras med en hand.

Utvecklingen av ett avbildningssystem har underlättat bestämningen av rumsliga inhomogeniteter i fotosyntetiskt aktiva prover. Dessa heterogeniteter uppstår i växternas blad, till exempel på grund av tillväxt, olika miljöpåfrestningar eller ett smittämne. Kunskap om provinhomogeniteter är avgörande för korrekt tolkning av provfotosyntetiska produktivitetsmätningar. Den höga bildkvaliteten ger möjlighet att analysera en enda cell eller till och med en enda kloroplast, samt områden som täcker hela löv eller växter.

Alternativa tillvägagångssätt

LIF-sensorer

Metoder baserade på Kautsky-effekten uttömmer inte hela mängden metoder för att mäta klorofyllfluorescens. I synnerhet ger de senaste framstegen inom laserinducerad fluorescens (LIF) en möjlighet att utveckla tillräckligt kompakta och effektiva sensorer för fotofysiologisk statusbestämning och biomassabedömning. Istället för att mäta det totala fluorescensflödet, registrerar sådana sensorer den optiska densiteten för detta flöde exciterad av starka nanosekundlaserpulser. Denna metod kräver inte 15–20 min mörkeranpassning (som är fallet med metoder baserade på Kautsky-effekten [14] ) och gör det möjligt att excitera provet från ett betydande avstånd. LIF-sensorer kan ge snabba och ganska långa avståndsbedömningar.

Se även

Icke-fotokemisk härdning

Anteckningar

↑ Lu Congming, Zhang Jianhua. Effekter av vattenstress på fotosystem II fotokemi och dess termostabilitet i veteväxter // Oxford Journals : journal. - 1999. - Juli. Arkiverad från originalet den 16 juni 2016.
↑ 1 2 3 4 Klorofyllfluorescens—en praktisk guide . jxb.oxfordjournals.org (1 april 2000). Datum för åtkomst: 28 mars 2011. Arkiverad från originalet 23 april 2012.
↑ 1 2 Effekter av bor och salthalt på röda hallon in vitro - International Journal of Fruit Science . Informaworld.com (3 december 2008). Hämtad: 28 mars 2011.
↑ Kitajima M., Butler WL Släckning av klorofyllfluorescens och primär fotokemi i kloroplaster med dibromotymokinon // Biochim Biophys Acta : journal. - 1975. - Vol. 376 . - S. 105-115 . - doi : 10.1016/0005-2728(75)90209-1 .
↑ Schreiber U., Schliwa U., Bilger W. Kontinuerlig registrering av fotokemisk och icke-fotokemisk klorofyllfluorescenssläckning med en ny typ av moduleringsfluorometer // Photosynth Res : journal. — Vol. 10 . - S. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 .
↑ Genty B., Briantais JM, Baker NR Förhållandet mellan kvantutbytet av fotosyntetisk elektrontransport och släckning av klorofyllfluorescens // Biochem Biophys Acta : journal. - 1989. - Vol. 990 . - S. 87-92 . - doi : 10.1016/s0304-4165(89)80016-9 .
↑ Sobrado. Bladegenskaper och dygnsvariation av klorofyllfluorescens i löv av "bana"-vegetationen i Amazonasregionen (engelska) (PDF). (inte tillgänglig länk)
↑ Växtstressbiologi . _ personalpages.manchester.ac.uk. Hämtad 6 januari 2017. Arkiverad från originalet 27 juli 2017.
↑ Favaretto et al. Differentiella reaktioner av antioxidantenzymer i pionjärer och sena tropiska trädarter som odlas under sol och skugga : journal . - 2011. Arkiverad den 19 september 2012.
↑ A. Cartelat, ZG Cerovic, Y. Goulas, S. Meyer, C. Lelarge, J.-L. Prioul, A. Barbottin, M.-H. Jeuffroy, P. Gate, G. Agati, I. Moya. Optiskt bedömt innehåll av bladpolyfenoler och klorofyll som indikatorer på kvävebrist i vete (Triticum aestivum L. ) : journal. — Field Crops Research Volume 91, Issue 1, pages 35-49, 2005. Arkiverad från originalet den 24 september 2015.
↑ Gitelson Anatoly A; Buschmann Claus; Lichtenthaler Hartmut K. The Chlorophyll Fluorescence Ratio F735/F700 as a Accurate Measure of the Chlorophyll Content in Plants // Remote Sensing of Environment : journal. - 1999. - Vol. 69 , nr. 3 . - s. 296-302 . - doi : 10.1016/S0034-4257(99)00023-1 .
↑ Schreiber U., Bilger W. och Schliwa U. Kontinuerlig registrering av fotokemisk och icke-fotokemisk kloropyhll-fluorescenssläckning med en ny typ av moduleringsfluorometer // Läkemedel : journal. - Adis International , 1986. - Vol. 10 . - S. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 . Arkiverad från originalet den 21 juli 2017.
↑ Schreiber Ulrich. Detektering av snabb induktionskinetik med en ny typ av högfrekvensmodulerad kloropyhll- fluorometer // Läkemedel : journal. - Adis International , 1986. - Vol. 9 . - S. 261-272 . - doi : 10.1007/bf00029749 . Arkiverad från originalet den 3 juni 2018.
↑ Handy PEA : Kontinuerlig excitationsanläggningens effektivitetsanalysator . - Norfolk: Hansatech Instruments, 2012. - P. 2. Arkiverad 7 april 2016 på Wayback Machine Arkiverad kopia (länk ej tillgänglig) . Hämtad 26 mars 2016. Arkiverad från originalet 7 april 2016. (obestämd)

Litteratur

Lazar. Klorofyll a-fluorescensinduktion // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics : journal. - 1999. - Vol. 1412 . - S. 1-28 . - doi : 10.1016/s0005-2728(99)00047-x .
Lazar. Den polyfasiska klorofyll-a-fluorescensökningen mätt under hög intensitet av spännande ljus // Functional Plant Biology : journal . - 2006. - Vol. 33 . - P. 9-30 . - doi : 10.1071/fp05095 .
Lazar. Parametrar för fotosyntetisk energifördelning (engelska) // Plant Physiology : journal. - American Society of Plant Biologists , 2015. - Vol. 175 . - S. 131-147 . - doi : 10.1016/j.jplph.2014.10.021 .
Kalaji et al. Experimentella in vivo-mätningar av ljusemission i växter: ett perspektiv tillägnat David Walker // Drugs : journal. - Adis International , 2012. - Vol. 114 . - S. 69-96 . - doi : 10.1007/s11120-012-9780-3 .
Maxwell, K.; Johnson, GN Klorofyllfluorescens--en praktisk guide (engelska) // Journal of Experimental Botany : journal. - Oxford University Press , 2000. - Vol. 51 , nr. 345 . - s. 659-668 . doi : 10.1093 / jexbot/51.345.659 . — PMID 10938857 .
Murchie och Lawson. Klorofyllfluorescensanalys: en guide till god praxis och förståelse för några nya tillämpningar // Journal of Experimental Botany : journal. - Oxford University Press , 2013. - Vol. 64 , nr. 13 . - P. 3983-3998 . - doi : 10.1093/jxb/ert208 .
Heinz Walz GmbH. Kloropyllfluorometer . _