Anti-CRISPR ( engelska Anti-CRISPR ) är ett proteinsystem , tack vare vilket bakteriofager (både bakterier och archaea ) motstår den destruktiva verkan av CRISPR /Cas-system. Anti-CRISPR-system har beskrivits i många bakteriofager. Proteinerna i dessa system stör i de flesta fall processen för måligenkänning och Cas-proteinernas arbete. Anti-CRISPR-system kan vara av bioteknologisk betydelse eftersom de kan användas för att finjustera genomredigering med CRISPR/ Cas9-teknologi .
Innan upptäckten av anti-CRISPR var det enda kända sättet som fager undviker att förstöras av CRISPR/Cas-systemet genom att förvärva punktmutationer . De påverkar praktiskt taget inte fagens livsduglighet, men de stör komplementariteten i parningen av fag -DNA med guide-RNA :t , på grund av vilket CRISPR/Cas-systemet inte kan känna igen det virala genetiska materialet . Däremot hittar mikroorganismer snabbt ett sätt att kringgå detta skydd genom att infoga nya fragment av främmande DNA i deras genom . De första anti-CRISPR-proteinerna upptäcktes 2013 i flera besläktade fager som attackerar bakterien Pseudomonas aeruginosa . Teoretiskt, om en fag integreras i genomet hos en bakterie som har ett aktivt CRISPR/Cas-system, kommer bakterien att dö eftersom den skär sitt eget genom. Införandet av vissa fager i genomet hos bakterier med aktiv CRISPR/Cas ledde dock inte till celldöd. När man jämförde genomen hos fager som orsakar bakteriecellers död, och fager som inte leder till celldöd, visade det sig att de senare har ett speciellt lokus som innehåller tio helt olika och mycket korta gener (150-450 nukleotider långa ). Det visade sig att proteinprodukterna från fem av dem (acrF1-acrF5) stör CRISPR/Cas-systemet av IF-typ i P. aeruginosa , och ytterligare fyra (acrE1-acrE4) blockerar systemet av IE-typ i samma bakterie. Anti-CRISPR-gener har identifierats inte bara i P. aeruginosa -fager , utan också i plasmider och konjugativa öar av denna bakterie [1] .
Aminosyrasekvenserna för anti-CRISPR-proteiner varierar kraftigt och saknar något gemensamt motiv som skulle hjälpa till att identifiera liknande gener i genomen hos andra bakteriofager med hjälp av vanliga bioinformatiska metoder . Det visade sig dock att miljön för anti-CRISPR-gener är väldigt lika: efter själva anti-CRISPR-generna har alla en gen som kodar för transkriptionsfaktorn Aca1 ( anti-CRISPR-associerad 1 ) [1] . Fager som saknar anti-CRISPR-gener saknar också aca1 -genen . Dessutom bildar anti-CRISPR-generna och aca1 -genen ett enda operon , och Aca1-proteinet verkar reglera anti-CRISPR- uttrycket i enlighet med stadiet av faginfektionscykeln . Aca1-proteinet har ett helix-turn-helix-strukturmotiv , som ofta finns bland transkriptionsfaktorer. För att fastställa om den studerade regionen av bakteriofaggenomet kodar anti-CRISPR-proteiner, kontrollerade forskarna om det fanns en gen som kodar för ett protein med "helix-turn-helix"-motivet omedelbart efter det. Med detta tillvägagångssätt har anti-CRISPR-proteiner som verkar mot typ I-system upptäckts i bakteriofager av en mängd olika proteobakterier . Samma tillvägagångssätt ledde till upptäckten av anti-CRISPR-störande typ II-system [1] [2] .
Nyligen har en databas med anti-CRISPR-proteiner, antiCRISPRdb, skapats, där vem som helst kan hitta känd information om ett anti-CRISPR-protein av intresse [3] .
Idag är 22 familjer av anti-CRISPR- proteiner kända. De förenas endast av sin ringa storlek (från 50 till 150 aminosyrarester), de har inget gemensamt motiv, och inget av dem liknar något protein med en känd funktion. Därför visade det sig vara omöjligt att föreslå verkningsmekanismen för anti-CRISPR med hjälp av bioinformatik. Hittills har det varit möjligt att fastställa verkningsmekanismen för sex anti-CRISPR-proteiner med hjälp av genetiska , biokemiska och strukturella metoder. Teoretiskt sett kan anti-CRISPR-proteiner påverka driften av CRISPR/Cas i flera stadier [1] . Dom kan:
För närvarande har verkan av anti-CRISPR-proteiner i de två senaste scenarierna beskrivits. Till exempel fäster AcrF1- och AcrF2-proteiner till komplexet av Cas-proteiner och RNA, vilket hindrar det från att binda till främmande DNA. AcrF3-proteinet interagerar med Cas3-proteinet, som har helikas- och nukleasaktiviteter , och hindrar det från att gå med i komplexet av andra Cas-proteiner och RNA som redan har bundit mål-DNA:t. AcrIIC1 binder till nukleasdomänen av Cas9-proteinet (det enda Cas-proteinet i typ II-system), vilket hindrar det från att skära DNA [1] .
Vissa anti-CRISPR-proteiner är aktiva mot flera CRISPR/Cas-system. Till exempel undertrycker anti-CRISPR-proteiner som verkar mot typ II-A-system funktionen av homologa Cas9-proteiner, vars aminosyrasekvenser endast är 53% lika [1] [2] .
Nyligen genomförda studier har visat att enbart punktmutationer inte är tillräckligt för att bakteriofager ska slippa effekten av CRISPR/Cas. Fagen måste ha minst en anti-CRISPR-gen för att undvika att bli helt dödad när den samodlas med bakterier med aktiva CRISPR/Cas-system. Tydligen bidrar ett så starkt urval till mångfalden av aminosyrasekvenser och verkningsmekanismer för anti-CRISPR. Anti-CRISPR-proteiner fungerar som viktiga faktorer i utvecklingen av mikroorganismer. Således leder införandet av mobila genetiska element med generna av sådana proteiner i bakteriegenomet till permanent inaktivering av CRISPR/Cas-systemen på grund av det stabila uttrycket av anti-CRISPR. En cell i detta tillstånd kan inte motstå inträde av andra transponerbara genetiska element och därför horisontell genöverföring . Vid långvarig inaktivering av CRISPR/Cas kan en bakterie helt förlora cas -generna eller ackumulera mutationer som gör dem icke-funktionella. Bioinformatisk analys av olika bakteriers CRISPR/Cas-system visade att cirka 12 % av dem är icke-funktionella på grund av förlusten av cas -gener eller skadliga mutationer i dem. Det har experimentellt visat sig att under förhållanden där förvärvet av främmande DNA är fördelaktigt, kan bakterier helt förlora CRISPR/Cas-systemet [2] .
För närvarande är anti-CRISPR-proteiner kända som undertrycker aktiviteten av Cas9 av bakterien Streptococcus pyogenes (detta enzym används oftast för att redigera genom med CRISPR/Cas-system). Dessutom gör två av dem det i mänskliga celler och blockerar genomredigering. Därför kan anti-CRISPR-proteiner reglera genomredigering av CRISPR/Cas, till exempel, lämna systemet aktivt endast i vissa vävnader och organ , endast i vissa stadier av embryonal utveckling, eller endast vid vissa ögonblick av cellcykeln . Dessutom kommer användningen av anti-CRISPR att bidra till att minska frekvensen av oplanerade mutationer som introduceras av Cas9. Vanligtvis är Cas9 aktiv tills cellen förstör antingen enzymet eller guide-RNA:t, och en för lång period av Cas9-aktivitet resulterar ofta i mutationer utanför målgenen. Många mänskliga bakteriepatogener har aktiva CRISPR/Cas-system, och användningen av anti-CRISPR-proteiner kan avsevärt öka effektiviteten av fagterapi . Således kan anti-CRISPR-proteiner få bred tillämpning inom bioteknik, genteknik och medicin i framtiden [1] .