Jonhalvledarsekvensering ( eng. Ion Semiconductor Sequencing ) är en metod för att bestämma DNA-sekvensen baserad på detektion av vätejoner som frigörs under DNA-polymerisation. Detta är en "sekvensering-på-syntes"-teknik i vilken en komplementär sträng konstrueras från sekvensen av en mallsträng.
Mikrobrunnar som innehåller mall-DNA-molekylen som ska sekvenseras laddas med en typ av deoxiribonukleotidtrifosfat (dNTP). Om den introducerade dNTP är komplementär till mallens ledande nukleotid, ingår den i den växande komplementära strängen. Detta orsakar frisättning av vätejoner, vilket utlöser ISFET -jonsensorn , vilket indikerar att en reaktion har ägt rum. Om en upprepning av en nukleotid finns i sekvensen av mallkedjan kommer flera dNTP-molekyler att fästas i en cykel. Detta leder till en ökning av antalet bildade vätejoner och en proportionellt högre elektrisk signal.
Denna teknik skiljer sig från andra sekvenseringsteknologier genom att den inte använder modifierade nukleotider och optiska sensorer. Jonhalvledarsekvensering kan också hänvisas till som jontorrentsekvensering, pH-medierad sekvensering eller halvledarsekvensering. Tekniken, som utvecklats av Ion Torrent Systems, Inc., licensierades från DNA Electronics Ltd, [1] [2] och släpptes i februari 2010. [3] Ion Torrent placerade sina system som snabba, kompakta och ekonomiska sequencers lämpliga för många laboratorier som professionella system. [4] Roches 454 Life Sciences samarbetar med DNA Electronics för att utveckla en kompakt DNA-plattform med lång sekvensläsning med denna teknologi. [5]
Inkorporeringen av deoxiribonukleotidtrifosfat (dNTP) i den växande DNA-kedjan sker med bildandet av en kovalent bindning och frisättningen av pyrofosfat och en positivt laddad vätejon. [1] [3] [6] dNTP kommer endast att inkluderas om det är komplementärt till den ledande oparade nukleotiden i mallsträngen. Jonhalvledarsekvensering bygger på det faktum att när en typ av dNTP ersätts med en annan frigörs en vätejon.
Omodifierade A-, C-, G- eller T -dNTP: er flödas sekventiellt in i varje mikrobrunn på ett halvledarchip som innehåller en enkelsträngad DNA-mallmolekyl som ska sekvenseras och DNA-polymeras . [3] [7] [8] Om den introducerade dNTP är komplementär till nästa oparade nukleotid på mallsträngen, inkorporeras den i den växande komplementära strängen av DNA-polymeras. [9] Om det införda dNTP inte är komplementärt inträffar inte polymerisationsreaktionen. Vätejonen som frigörs i reaktionen ändrar pH i lösningen, vilket detekteras av ISFET . [1] [3] [7] Oreagerade dNTP-molekyler tvättas ut före nästa cykel när andra dNTP-arter introduceras. [7]
ISFET- sensorer är placerade under det jonkänsliga lagret av mikrobrunnar . [4] Alla lager är placerade på ett CMOS-chip, liknande de som ofta används inom elektronikindustrin. [4] [10]
Varje chip innehåller en rad mikrobrunnar med motsvarande ISFET- sensorer. [7] Varje utsänd vätejon triggar ISFET- sensorn. En serie elektriska impulser som överförs från ett chip till en dator omvandlas till en DNA-sekvens utan mellanliggande signalomvandling, [7] [11] eftersom elektronik direkt registrerar händelserna av nukleotidinneslutningar i kedjan, utan användning av märkta nukleotider och optisk mätningar. [4] [10] Signalbehandling och DNA-sekvensmontering kan göras i programvara.
Noggrannheten för jonhalvledarsekvensering i februari 2011 var 99,6 % med ett 50-nukleotidfragment (läst), 100 Mb per passage. [12] I februari 2011 var längden på de sekvenserade fragmenten 100 baspar. [12] Noggrannheten för att läsa upprepningar 5 nukleotider långa var 98%. [12] Dessa uppgifter har ännu inte verifierats oberoende utanför företaget.
De främsta fördelarna med jonhalvledarsekvensering är hög sekvenseringshastighet med låga initiala investerings- och driftskostnader. [8] [11] Detta möjliggjordes av frånvaron av modifierade nukleotider och optiska mätningar.
Eftersom systemet registrerar händelser av nukleotidtillsatser gjorda av naturligt polymeras, kan sekvensering ske i realtid. Faktum är att hastigheten för sekvensering begränsas av hastigheten för förändring av nukleotidsubstrat . [13] Ion Torrent Systems, utvecklaren av teknologin, hävdar att mätningen (fixeringen) av varje nukleotidtillsats tar 4 sekunder, och varje körning varar ungefär en timme, under vilken en sekvens på 100-200 nukleotider sekvenseras. [11] [14] Framsteg inom området för halvledarchips (som förutspås av Moores lag ) tyder på att antalet läsningar per chip (och därför per körning) bör öka. [elva]
Anskaffningskostnaden för en pH-medierad sequencer från Ion Torrent Systems, Inc vid lanseringen var cirka 50 000 USD, exklusive provberedningsutrustning och en server för dataanalys. [8] [11] [14] Kostnaden per körning är också betydligt lägre än alternativa automatiserade sekvenseringsmetoder på cirka 1 000 USD. [8] [12]
Om en homopolymer bestående av upprepningar av samma nukleotid (t.ex. GGGGG) finns på mallsträngen (som ska sekvenseras), fästs flera nukleotider på en gång och fler vätejoner bildas i en cykel. Detta resulterar i en större förändring i pH och en proportionellt högre elektronisk signal. [11] Begränsningen med detta system är att det är svårt att beräkna längden på upprepningen. Denna begränsning delas av andra metoder som detekterar enstaka nukleotidinsertioner, såsom pyrosekvensering . [15] Signaler som genereras av en lång upprepning är svåra att skilja från liknande sådana med andra längder, till exempel är en 7 nukleotider lång upprepning svår att skilja från en 8 nukleotider lång homoupprepning.
Det fanns också en signifikant närvaro av sekvenseringsfel i form av enstaka nukleotidinsertioner och deletioner, vanligtvis i heterozygot tillstånd. För att lösa detta problem har Life Technologies släppt en uppdatering av Ion Reporter-programvaran.
En annan nackdel med detta system är den korta läslängden jämfört med andra sekvenseringsmetoder som Sanger-sekvensering eller pyrosequencing . Stora lästa fragmentlängder är användbara för de novo genomsammansättning . Hittills är läslängden som uppnåtts av Ion Torrent Systems, Inc. 600 baspar per pass. [3] [8] För närvarande är genomströmningen lägre än andra högkapacitetssekvenseringsteknologier, även om utvecklare hoppas kunna ändra detta genom att öka tätheten av mikrobrunnar per chip . [3] Under 2018 släpptes en ny serie sekvenserare Ion GeneStudio S5, som är jämförbar i prestanda med andra helgenomsekvenseringsteknologier, samtidigt som de överträffar dem i hastighet.
Jonhalvledarsekvensering är positionerad på marknaden som en snabb, kompakt och ekonomisk sekvenseringsmaskin som kan användas i ett stort antal laboratorier som en avancerad maskin. [3] [4] Företaget hoppas att deras system kommer att användas inte bara i specialiserade centra, utan också på sjukhus och små universitets- och industrilaboratorier. En New York Times-artikel från januari 2011, "Taking DNA Sequencing to the Masses", belyser denna ambition. [16]
Eftersom alternativa sekvenseringsmetoder kan uppnå längre läslängder (och därför är mer lämpade för helgenomanalys ), kan denna teknologi vara mest lämplig för småskaliga tillämpningar såsom mikrobiell genomsekvensering, mikrobiell transkriptomsekvensering , målsekvensering, amplikonsekvensering eller för kvalitetskontroller av bibliotekssekvensering. [3] [8]