Kryoelektronmikroskopi (cryo-EM, eng. cryo-EM ) eller elektronkryomikroskopi är en form av transmission elektronmikroskopi (TEM, eng. TEM ) , där provet är undersökt under kryogena temperaturer (vanligtvis i flytande kväve ). CryoEM vinner popularitet inom strukturell biologi , eftersom det gör att exemplar som inte har färgats eller på annat sätt fixerats kan observeras och visa dem i sin ursprungliga miljö. Detta i motsats till röntgenkristallografi , som kräver att provet kristalliseras , vilket kan vara svårt, och placeras i icke-fysiologiska miljöer, vilket ibland kan leda till funktionellt olämpliga konformationsförändringar.
Upplösningen av kryo-EM-kartor har stadigt förbättrats, och 2014 erhölls strukturer med nära atomär upplösning, inklusive virus , ribosomer , mitokondrier , jonkanaler och enzymkomplex, totalt 170 kD vid 4,5 Å upplösning. Bridget Carragher och hennes kollegor vid Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopy använde metoderna som hon och Clint Potter hade utvecklat för att skapa den första sub-3 ångströms kryoelektronmikroskopiavbildningen inom strukturbiologin , och därmed höja profilen för kryo-EM som en verktyg som nu är jämförbart med och potentiellt överlägset konventionella röntgenkristallografimetoder. I juni 2015 publicerades en 2,2Å karta över bakterieenzymet beta-galaktosidas . En version av elektronkryomikroskopi är kryoelektrontomografi (CET), där en 3D-rekonstruktion av ett prov skapas med en 2D-lutad bild.
2017 års Nobelpris i kemi tilldelades Jacques Dubochet , Joachim Frank och Richard Henderson "för utvecklingen av kryoelektronmikroskopi för högupplöst strukturbestämning av biomolekyler i lösning" [1] [2] [3] .
Ursprungligen var kryoelektronmikroskopi tänkt att användas som ett medel för att bekämpa strålningsskador på biologiska prover. Mängden strålning som krävs för att samla in en bild av ett prov i ett elektronmikroskop är tillräckligt stor för att vara en potentiell källa till provskador för ömtåliga strukturer. Dessutom gör det höga vakuumet som krävs för en elektronmikroskopkolonn provmiljön ganska hård.
Problemet med vakuum löstes delvis genom införandet av negativ färgning , men även med det var biologiska prover föremål för strukturell kollaps när provet dehydrerades . Möjligheten att sänka prover i is under sublimeringstemperaturen övervägdes tidigt, men när vatten fryser tenderar det att lägga sig i ett mindre tätt kristallgitter, och detta kan förstöra strukturen på allt som är inbyggt i det.
I början av 1980 -talet försökte flera fasta fysikgrupper producera glasaktig is på olika sätt, som högtrycksfrysning eller snabbfrysning. I den ursprungliga uppsatsen från 1984 visade en grupp ledd av Jacques Dubochet vid European Molecular Biology Laboratory bilder av ett adenovirus inbäddat i ett förglasat vattenlager. Den här artikeln anses allmänt vara ursprunget till kryoelektronmikroskopi, och tekniken har utvecklats till den grad att den blivit standard i många laboratorier runt om i världen.
Energin hos elektronerna som används för att producera bilden (80-300 kV) är tillräckligt hög för att bryta de kovalenta bindningarna. Vid avbildning av prover som är känsliga för strålningsskador är det nödvändigt att begränsa den elektronexponering som används för att ta bilden. Dessa låga exponeringar kräver att bilder av tusentals eller till och med miljontals identiska frusna molekyler väljs ut, justeras och medelvärdesbildas för att producera högupplösta kartor med hjälp av specialiserad programvara. En betydande förbättring av strukturella egenskaper uppnåddes 2012 genom införandet av direkta elektrondetektorer och bättre beräkningsalgoritmer.
Tunn film
Biologiskt material sprids över ett elektronmikroskopinät och hålls i fruset hydratiserat tillstånd genom snabb frysning, vanligtvis i flytande etan vid flytande kvävetemperatur. Genom att hålla proverna vid flytande kvävetemperatur eller kallare, kan de införas i högvakuumläget i elektronmikroskopkolonnen. De flesta biologiska prover är extremt känsliga för strålning, så de måste avbildas med låga doser (till hjälp ger den låga temperaturen vid kryoelektronmikroskopi en ytterligare skyddande faktor mot strålningsskador).
Därför är bilderna mycket brusiga. För vissa biologiska system är det möjligt att medelvärde bilder för att öka signal-brusförhållandet och extrahera högupplöst information om provet med hjälp av en teknik som kallas singelpartikelanalys. Detta tillvägagångssätt kräver i allmänhet att medelvärdena är identiska, även om viss begränsad konformationell heterogenitet (t.ex. ribosom) nu kan utforskas. 3D-rekonstruktioner från kryo-EM-bilder av proteinkomplex och virus har lösts till subnanometer eller nära atomär upplösning, vilket ger nya insikter om strukturen och biologin hos dessa stora sammansättningar.
Analys av ordnade proteinmatriser, såsom tvådimensionella kristaller av transmembranproteiner eller spiralformade proteinmatriser, möjliggör också medelvärdesberäkning, vilket kan ge högupplöst information om provet. Denna metod kallas elektronkristallografi.
glaskroppssektion
Tunnfilmsmetoden är begränsad till tunna prover (vanligtvis <500 nm) eftersom elektroner inte kan korsa tjockare prov utan flera spridningshändelser. Tjockare prover kan förglasas genom nedsänkning (kryofixering) i etan (upp till tiotals µm tjocka) eller vanligare genom högtrycksfrysning (upp till hundratals µm). De kan sedan skäras i tunna sektioner (mellan 40 och 200 nm tjocka) med en diamantkniv i en kryotramikrotom vid temperaturer under -135 °C (avglasningstemperatur). Tvärsnitten samlas på ett elektronmikroskopgaller och visas på samma sätt som ett prov förglasat i en tunn film. Denna teknik kallas kryoelektronmikroskopi av glaskroppssektioner (CEMOVIS) eller kryoelektronmikroskopi av frusna hydratiserade sektioner.
Förutom att visualisera förglasade biologiska prover, kan cryo-EM också användas för att avbilda prover av material som är för flyktiga i vakuum för avbildning med standardelektronmikroskopi vid rumstemperatur. Till exempel kan förglasade vätske-fasta gränssnitt extraheras för cryo-EM-analys, och svavel, som är känsligt för sublimering i vakuumet i elektronmikroskop, kan stabiliseras och avbildas i cryo-EM [4] [5] .
Många metoder kan användas i kryoelektronmikroskopi. Populära metoder: