Gram metod

Den aktuella versionen av sidan har ännu inte granskats av erfarna bidragsgivare och kan skilja sig väsentligt från versionen som granskades den 16 juli 2019; kontroller kräver 5 redigeringar .

Grammetoden  är en metod för att färga mikroorganismer för forskning, som gör det möjligt att differentiera bakterier efter de biokemiska egenskaperna hos deras cellvägg . Föreslagen 1884 av den danske läkaren Hans Christian Gram .

Enligt Gram färgas bakterier med anilinfärgämnen  - gentiana eller metylviolett , etc., sedan fixeras färgen med en lösning av jod . Vid efterföljande tvättning av det färgade preparatet med alkohol kallas de typer av bakterier som visar sig vara fast färgade blå och har en tjock cellvägg grampositiva bakterier, betecknade Gram (+) , - i motsats till gramnegativa (tunna ) cellvägg), Gram (-) , som missfärgades vid tvätt.

Efter sköljning med lösningsmedel tillsätter Gram-färgen ett kontrasterande rött färgämne som färgar alla gramnegativa bakterier röda eller rosa. Detta beror på närvaron av ett yttre membran som förhindrar att färgämnet tränger in i cellen. Testet klassificerar bakterier i två grupper baserat på strukturen på deras cellvägg.

Använd i diagnostik

Gramfärgning är av stor betydelse för bakteriers taxonomi, såväl som för den mikrobiologiska diagnosen av infektionssjukdomar.

Gram-positiva kokkar (förutom representanter för släktet Neisseria ) och sporbärande (med undantag för Coxiella burnetii ) former av bakterier, färgar de blå-svart ( mörkblå ) färg .

Många icke-sporbärande bakterier är gramnegativa och färgas röda eller rosa.

Färgningsteknik

Gramfärgning hänvisar till en komplex metod för färgning när ett utstryk utsätts för två färgämnen, varav ett är det huvudsakliga och det andra är ett ytterligare. Förutom färgämnen används blekmedel för komplexa färgmetoder: alkohol, syror etc.

För Gramfärgning används oftare anilinfärgämnen av trifenylmetangruppen: gentiana, metylviolett eller kristallviolett . Grampositiva mikroorganismer ger ett starkt samband med de angivna färgämnena och jod. Samtidigt missfärgas de inte när de utsätts för alkohol, som ett resultat av vilket grampositiva mikroorganismer med ytterligare färgning med fuchsin inte ändrar den initialt antagna lila färgen.

Gramnegativa mikroorganismer bildar en förening som lätt förstörs av alkohol med basiska färgämnen och jod . Som ett resultat blir mikroberna missfärgade och färgas sedan med magenta och blir röda.

Förbereder material för målning

  1. Testmaterialet sprids i ett tunt lager över ytan av en väl avfettad glasskiva.
  2. Det beredda smeten torkas i luft och fixeras efter fullständig torkning.
  3. Histologiska snitt förbereds enligt standardmetoden, fixering av vävnadsbitar i formalin och häll dem i paraffin.

Fixar

Vid fixering fixeras smeten på ytan av glasskivan, och därför tvättas inte mikrobiella celler bort under den efterföljande färgningen av preparatet. Dessutom färgar dödade mikrobiella celler bättre än levande.

Man skiljer på den fysikaliska fixeringsmetoden, som bygger på effekten av hög temperatur på den mikrobiella cellen, och kemiska metoder, som innebär användning av kemikalier som orsakar koagulering av cytoplasmatiska proteiner.

Fysiskt sätt att fixa

Glasskivan med preparatet tas med en pincett eller högerhands I- och II-fingrar av revbenen med ett slag uppåt och med en jämn rörelse 2-3 gånger över den övre delen av brännarlågan. Hela fixeringsprocessen bör inte ta mer än 2 sekunder.

Tillförlitligheten av fixeringen kontrolleras med följande metod: ytan på glaset som är fri från smeten appliceras på baksidan av vänster hand. Med korrekt fixering av smeten ska glaset vara varmt, men inte orsaka en brännande känsla (70-80 ° C).

Kemisk fixeringsmetod

För att fixera utstrykarna , metylalkohol , aceton , Nikiforovs blandning (en blandning av etylalkohol 96% och anestesiester i förhållandet 1: 1), Carnoys vätska (96% etylalkohol - 60%, kloroform  - 30%, isättika syra  - 10%), alkohol-formol (40% formalin  - 5 ml, 96% etylalkohol - 95 ml). Ett objektglas med ett torkat utstryk nedsänks i en flaska med ett fixeringsmedel i 10-15 minuter och torkas sedan i luft. Fixering i par av 40% formalin under några sekunder används också.

Processen att färga utstryk

  1. Ett av huvudfärgämnena hälls på ett fixerat utstryk i 2-3 minuter. För att undvika utfällning, färga genom filterpapper.
  2. Töm färgen, ta försiktigt bort filterpapperet. Utstryket fylls med Lugols lösning eller Grams jodidlösning (en vattenlösning av kaliumjodid och kristallint jod i förhållandet 2:1) i 1-2 minuter tills preparatet blir svart.
  3. Lösningen dräneras, smeten sköljs med 96 ° etylalkohol eller aceton , häll och dränera tills smeten är missfärgad och den flytande vätskan är klar (ungefär 20-40-60 sekunder).
  4. Objektglasen tvättas noggrant i rinnande eller destillerat vatten i 1-2 minuter.
  5. För att identifiera den gramnegativa gruppen av bakterier färgas preparaten dessutom med fuchsin eller safranin (2–5 min).
  6. Skölj i rinnande vatten och torka med filterpapper.

Gram- Weigert färgningsteknik för bakterier i histologiska sektioner

  1. Avparaffiniserade sektioner bringas till vatten.
  2. Färga i 20 minuter i en 1% lösning av pararosanilin eller basiskt fuchsin i 1% ättiksyra (färgämneslösningen värms till kokning, kyls och filtreras).
  3. Tvättas i 3 byten destillerat vatten.
  4. Färga i 5 min i 1% kristallviolett i destillerat vatten.
  5. Skölj snabbt i 1% natriumkloridlösning.
  6. Behandlas i 30 s i en blandning: 1 del jod + 2 delar kaliumjodid + 100 delar destillerat vatten.
  7. Blöt med filterpapper.
  8. Differentiera genom att applicera en blandning av lika volymer anilin och xylen (1-2 ml) på snittet; lösningarna dräneras tills färgämnesmolnen slutar röra sig bort från snittet.
  9. Utför genom 3 byten av xylen.
  10. Innesluten i balsam eller annat harts löst i xylen.

Resultat: Gram-positiva bakterier är blåsvarta, fibrin är lila, kärnor är röda.

Se även

Litteratur

På tyska
  • Gram, HCÜber die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten  (tyska)  // Fortschritte der Medizin: magazin. - 1884. - Bd. 2 . - S. 185-189 .
På engelska
  • Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter HA Sneath. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology  (engelska) . — 9:e upplagan — Lippincott Williams & Wilkins, 1994.
  • Madigan, M.T.; Martinko J; Parker J. Brock Biology of Microorganisms  (obestämd) . — 10:e upplagan. Lippincott Williams & Wilkins, 2004.
  • Ryan, KJ; Ray, C.G. Sherris Medicinsk mikrobiologi  (obestämd) . - 4:e upplagan - McGraw Hill., 2004.
  • Applicering av fläckar i klinisk mikrobiologi // Biotechnic & Histochemistry, volym 76, nummer 3, maj 01, 2001, pp. 119-125(7)
  Gå till Wikidata-objektet  Ordböcker och uppslagsverk