Mikroelektrod av glas

En mikroelektrod av glas  är en mycket tunn glaspipett fylld med en elektrolyt . Används inom elektrofysiologi . Utvecklingen av mikroelektrodmetoder gjorde det möjligt att genomföra elektrofysiologiska studier på individuell cellnivå.

Diametern på spetsen på en glasmikroelektrod är cirka 0,5 µm, ibland mindre än 0,1 µm [1] , när den ses genom ett optiskt mikroskop kan den vara omöjlig att särskilja.

Detta instrument bör inte förväxlas med de smala modellerna av jonometriska glaselektroder , i synnerhet de som också används inom elektrofysiologi.

Applikation

Det finns tre huvudsakliga sätt att använda mikroelektroder:

En vidareutveckling av mikroelektrodteknologin var metoden för lokal fixering av potentialen ( patch clamp method ) [2] . Speciella typer av mikroelektroder som utvecklats för denna metod kallas vanligtvis mikropipetter . Metodens känslighet gör det möjligt att registrera aktiviteten hos individuella jonkanaler i cellmembranet.

Historik

Före utvecklingen av glasmikroelektroder inom fysiologi användes metallelektroder, till exempel från elektrokemiskt jordad volframtråd [3] . Det låga elektriska motståndet hos metallelektroder gjorde det möjligt att använda primitiv inspelningsutrustning med låg ingångsresistans med dem. I vissa områden används sådana elektroder än idag.

Glasmikroelektroder användes först 1949 [4] av G. Ling och R.V. Gerard i deras arbete med att registrera membranpotentialen hos grodmyocyter .

V. L. Nastuk och A. L. Khodzhkin 1950, med hjälp av [5] mikroelektrodteknik, registrerade aktionspotentialen hos en muskelfiber.

Användningen av glasmikroelektroder för applicering av ämnen på cellmembranet föreslogs av VL Nastuk 1953 [6] .

I Sovjetunionen omsattes mikroelektrodtekniken i praktiken av Platon Grigoryevich Kostyuk [7] . Vid biologiska fakulteten vid Moscow State University använde GA Kurella i sitt arbete både mikroelektrodteknik och jonometriska miniatyrelektroder av glas för studier av subcellulära strukturer[ förtydliga ] [8] .

Design och tillverkning

Materialet för tillverkning av mikroelektroder är en glaskapillär med en diameter på cirka 1 mm. Vanligtvis använder de märket av glas " Pyrex ", mindre ofta använder de andra typer av glas - aluminosilikat 38-ЗС och kvartsglas. Ofta tas en kapillär med glasfilament smält in i den som ämnen - i det här fallet underlättas fyllningen av mikroelektroden med elektrolyt i framtiden. Ämnen rengörs noggrant.

Förbereder mikropipetten

En glasmikroelektrod görs genom att sträcka och bryta en uppvärmd kapillär på en speciell anordning - en avdragare (mikrosmide). Parametrarna för den resulterande mikroelektroden beror på den valda typen av glas, kapillärdiameter, uppvärmningstemperatur, ögonblick för starten av rycket och dess styrka. [1] De mest avancerade modellerna av moderna mikroprocessorstyrda avdragare gör det möjligt att programmera olika former av spetsen på en indragbar mikropipett [9] , vilket ger förutbestämda egenskaper och god repeterbarhet.

Den cylindriska delen av det resulterande arbetsstycket smalnar gradvis av och förvandlas till den genomträngande delen. De långsträckta mikropipetterna undersöks under ett mikroskop; med en genomträngande spetsdiameter på mindre än 0,5 μm är den omöjlig att särskilja, försvinner i interferensfransen. I vissa fall är spetsen på mikroelektroden dessutom skärpt eller smält på ett speciellt sätt.

Mikroelektroder för lappklämmor är dessutom belagda med silikon för att säkerställa bildandet av en gigaohm-kontakt när cellmembranet berörs.

Fylla elektroden

Arbetsstycket är fyllt med en elektrolyt, oftast med en 2–3 M lösning av kaliumklorid. Ibland används elektrolyter av en annan sammansättning eller så är elektroden fylld med en lågsmältande metall, till exempel Woods legering [10] .

Att fylla elektroderna kan vara svårt på grund av den mycket lilla diametern på dess arbetsdel. För att underlätta det har ett antal tekniker föreslagits: fylla i vakuum, förfylla med alkohol och sedan ersätta alkoholen med en elektrolyt [11] . För närvarande används den metod som föreslagits av Tasaki [12] med användning av en glasfiber smält till en mikropipett i stor utsträckning, medan mikroelektroden fylls under inverkan av kapillärkrafter [13] .

Anslutning och kontroll

För att ansluta elektroderna till mätutrustningen fästs de i en hylshållare fylld med elektrolyt eller en klorerad silvertråd sätts in i den cylindriska delen av den fyllda elektroden .

Kvaliteten på den fyllda och anslutna mikroelektroden styrs genom att mäta dess motstånd, som har storleksordningen enheter av megaohm. Ett lägre motstånd indikerar att spetsen på mikroelektroden är avbruten, ett större eller kaotiskt föränderligt motstånd indikerar att den genomträngande spetsen är igensatt av smuts.

Färdiga mikroelektroder lagras dåligt, så de görs vanligtvis omedelbart innan experimentets start [14] . Under en tid, inte mer än en dag, kan de förvaras i kylskåpet, nedsänkta i ett glas med elektrolyt. Vid långtidslagring förlorar elektroderna sin användbarhet på grund av elektrolytens kristallisering, det är möjligt att övervuxa dem med kolonier av mikroorganismer [15] .

Fysikaliska och kemiska egenskaper hos mikroelektroder

Olika fysikalisk-kemiska processer äger rum mellan mikroelektroden och mediet som den är nedsänkt i (fysiologisk lösning, cellinnehåll).

Elektriska egenskaper hos mikroelektroder

Elektriskt motstånd  är den viktigaste parametern för en mikroelektrod. Resistansen måste kontrolleras innan försökets start, och i vissa fall även under arbetets gång. För en giltig elektrod är resistansen mellan 5 och 20 MΩ. Motstånd mindre än 1 MΩ är ett tecken på en trasig genomträngande del, mer än 60 MΩ - spetsen på elektroden är för tunn, eller igensatt med utfällda kristaller eller partiklar från föremålet som studeras [17] . Slumpmässigt växlande motstånd är också karakteristiskt för en förorenad elektrod [14] . Elektroder med hög resistans har stort inre brus och känslighet för elektromagnetiska störningar. Vid strömmar som överstiger 1 nA kan mikroelektrodernas ström-spänningsegenskaper bli olinjära. Beräkning av resistansen hos elektroder är möjlig, men det är komplicerat och ger inte hög noggrannhet, därför bestäms i praktiken elektrodens resistans experimentellt [18] .

elektrod kapacitans . Närvaron av en mikroelektrod med sin egen kapacitans förvränger formen på den inspelade signalen. Därför görs ansträngningar för att minska och kompensera för det: öka diametern på den cylindriska delen av elektroden, minska dess längd, försök att använda de kortaste möjliga ledningarna för att ansluta till förstärkaren. För att kompensera för kapacitansen hos elektroden i förstärkarens ingångssteg används kapacitiv negativ återkoppling . Kapacitanskompensation styrs genom att applicera en rektangulär signal till elektroden  - med rätt inställning förvrängs inte formen på dess front [19] .

Förskjutningspotential . Det uppstår av flera anledningar. De viktigaste är:

Förspänningspotentialen för elektroden som är ansluten till förstärkaren och nedsänkt i saltlösning kompenseras genom att justera förstärkaren.

För att minska den oönskade självpotentialen används även följande metoder [21] :

Typer av mikroelektroder

Flerkanaliga mikroelektroder

Flerkanaliga mikroelektroder används ofta i studier med jontofores (mikroelektrofores). De tillåter samtidig registrering av elektrisk aktivitet och införande av aktiva substanser från intilliggande mikropipettschakt. Vanligtvis är antalet kanaler för en sådan komplex elektrod minst tre: en tjänar till registrering, den andra för kompensation och kontroll av strömeffekter och den tredje för införandet av testämnet [22] .

De individuella kanalerna kan vara anordnade parallellt med varandra eller koaxiellt.

Den stora parasitiska kapacitansen hos flerkanalsmikroelektroder kompenseras ibland för genom att skapa en ledande skärm genom att sputtera metall eller grafit på dess icke-fungerande del [22] .

Centrifugering kan användas för att fylla flerkanaliga mikroelektroder med elektrolyt och lösningar av testämnen .

Framställningen av flerkanaliga mikroelektroder är tekniskt svår; det har hävdats att deras tillverkning är lika mycket en konst som det är en vetenskap [23] .

Kompositmikroelektroder

De används för samma ändamål som flerkanaliga. Kompositmikroelektroder skadar cellen kraftigare, men deras elektriska egenskaper överträffar ofta flerkanaliga. Samlade från separata mikroelektroder, kontrollerar arbete under ett mikroskop [22] .

Flytande mikroelektrod

Flytande mikroelektroder föreslagna av Woodbury och Brady [24] används för att registrera den elektriska aktiviteten hos celler i kontraktila vävnader, till exempel myokardium . De har en lätt design, med en mycket kort cylindrisk del och är fixerade på en tunn silver- eller volframtråd med en droppe lack. Med en mikromanipulator förs elektroden till vävnadens yta och sänks ned på den. Det injiceras i vävnaden under påverkan av sin egen vikt; när elektroden går in i cellen noteras ett spänningshopp.

På grund av trådens elasticitet kan elektroden röra sig tillsammans med vävnaden i vilken den förs in. I praktiken är det möjligt att hålla elektroden i cellen i flera minuter. .

Mikropipetter för lappklämmor

Förstärkare för att arbeta med glasmikroelektroder

Biopotentialförstärkare som används med glasmikroelektroder bör ha följande egenskaper [25] :

För att arbeta med patch clamp-metoden används specialiserade förstärkare.

Se även

Anteckningar

  1. ↑ 1 2 Kamkin, 2011 , sid. 26.
  2. ↑ Hamill OP, Marty F., Neher E. et al. Förbättrade patch-clamp-tekniker för högupplöst strömregistrering från cell- och cekk-fria membranplåster // Europ. J Physiok. - 1981. - Vol. 391(2) s.85-100.
  3. ↑ Kozhechkin, 1975 , sid. 63.
  4. ↑ 1949, G. Ling & RW Gerard, Den normala membranpotentialen hos grodasartoriusfibrer, i: J. Cell. Comp. Physiol., 34, sid. 383-96.
  5. ↑ Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). "Enstaka muskelfibrers elektriska aktivitet". J. Cell. Comp. physiol. 35:39-73
  6. ↑ Nastuk WL Den elektriska aktiviteten hos muskelcellsmembranet vid den neuromuskulära sammankopplingen - J. Cellular Comp. physiol. — v. 42, s. 249-272, 1953
  7. ↑ Kostyuk Platon Grigorievich // Stora sovjetiska encyklopedin  : [i 30 volymer]  / kap. ed. A. M. Prokhorov . - 3:e uppl. - M .  : Soviet Encyclopedia, 1969-1978.
  8. ↑ Om studierna av G. A. Kurella och Litvin F. F. - Kondrashin A. A., Samuilov V. D. Sun - energi - liv. // The Theory of Evolution As It Is Arkiverad 19 juli 2011 på Wayback Machine .
  9. ↑ [1] Arkiverad 13 februari 2018 på Wayback Machine Warner Instruments PMP-102 är en mikroprocessorstyrd avdragare.
  10. ↑ Shanes AM  - Elektrokemiska aspekter av fysiologisk och farmakologisk verkan i exciterbara celler - Pharmacol. Rev., v.10, s. 59-164, 1958
  11. ↑ Goffman B., Cranefield P. Hjärtats elektrofysiologi. — Översättning från engelska. Tsuzmer E.S. ed. Babsky E. B. - M .: Publishing House of Foreign Literature - 1962
  12. ↑ Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner MJ, Yu WY En enkel, direkt och snabb metod för att fylla mikroelektroder. — Fysiol. Behav., 1968, v.3, sid. 1009-1010.
  13. ↑ Kamkin, 2007 .
  14. ↑ 1 2 Stor workshop om fysiologi: lärobok. ersättning för studenter. högre lärobok institutioner / A. G. Kamkin och andra. M.: Izd. Center "Academy" 2007.
  15. ↑ Kozhechkin, 1975 , sid. 82.
  16. ↑ Kamkin, 1989 , sid. 108.
  17. ↑ Kamkin, 2011 , sid. 32.
  18. ↑ Kamkin, 1989 , sid. 112.
  19. ↑ Kamkin, 2011 , sid. 33.
  20. ↑ Kamkin, 2011 , sid. 34.
  21. ↑ Kozhechkin, 1975 , sid. 76.
  22. ↑ 1 2 3 Alexandrov A. A. Metod för mikroelektrofores i fysiologi. - L .: Nauka, 1983. - 148 sid. — (Fysiologisk forskningsmetoder).
  23. ↑ Kelly JS Mikrojontoforetisk applicering av läkemedel på enstaka neuroner. - I: Handbok i psykofarvakologi. New York; London, 1975, v.2, sid. 29-67
  24. ↑ Woodbury JW, Brady AJ Intracellulär inspelning från Moving Tissues with a Flexibly Mounted Microelectrode - Science, 123, sid. 100-101, 1956
  25. ↑ Kamkin, 2011 , sid. 43.

Anteckningar

  1. ↑ Med vissa förenklingar kan diffusionshastigheten (mol/s) uppskattas enligt följande: , där  är elektrolytkoncentrationen,  är diffusionskoefficienten,  är halva elektrodspetsens inre vinkel, konstant för denna typ av elektrod,  är inre radie av piercingspetsen. Dvs diffusionshastigheten är direkt proportionell mot tjockleken på den genomträngande spetsen och koncentrationen av elektrolyten som fyller mikroelektroden.

Litteratur