FAIRE-Seq ( Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements Sequencing ) är en molekylärbiologisk metod som används för att bestämma regulatoriska sekvenser (sektioner) av DNA [1] [2] . FAIRE-Seq är en kombination av chromatin regulatory element isolation (FAIRE) och high throughput sekvensering .
FAIRE är en av metoderna för att kartlägga öppna kromatinregioner , tillsammans med metoderna för DNase I-överkänslig ( DNase-seq ) och kromatinimmunoutfällning ( ChIP-seq , ChIP-on-chip). Idén med metoden föreslogs 2003 för fraktionering av Saccharomyces cerevisiae kromatin i 2 delar: den första är de regioner som transkriberas av RNA-polymeras II, den andra är icke-kodande sekvenser och regioner transkriberade av RNA-polymeras I eller III [ 3] . Separation utförs på grund av olika grader av formaldehydtvärbindning av enskilda kromatinregioner. Under 2007 identifierades regioner associerade med regulatorisk aktivitet i humant kromatin med denna metod; alltså klarade metoden testet och fick sitt namn FAIRE [4] . I den ursprungliga versionen baserades dataanalys på hybridisering av fluorescensmärkta DNA-fragment med DNA-mikroarrayer [4] , som senare kallades FAIRE-chip. I efterföljande arbeten föreslogs andra metoder för att analysera de erhållna DNA-fragmenten, bland vilka den vanligaste är FAIRE-seq [1] .
Hittills finns det flera varianter av metoden avsedd för vävnader från djur och växter. När man arbetar med växter krävs strängare villkor och lång formaldehydfixeringstid på grund av cellväggen, lövens vaxartade nagelband och luftutrymmena i det svampiga mesofyllet [5] . Förutom att kartlägga regulatoriska regioner tillåter metoden jämförelse av aktiva element i olika vävnader (både tumörer och friska). Experiment med FAIRE-seq tar i genomsnitt cirka tre dagar, exklusive analys och tolkning av data [6] .
I eukaryota celler observeras öppet kromatin i aktiva regulatoriska regioner; därför skulle isoleringen av regioner som inte är rika på nukleosomer göra det möjligt att kartlägga de regulatoriska elementen i genomet, oavsett celltyp [2] . När formaldehyd tillsätts till vävnadskultur bildas tvärbindningar mellan proteiner , proteiner och nukleinsyror, i synnerhet DNA och histoner, eller mellan histoner. Därefter utsätts genomiskt DNA för ultraljudsfragmentering till segment 300-400 baspar långa i genomsnitt. Under efterföljande extraktion med fenol-kloroform kommer proteinfritt DNA att vara i vattenfasen och kovalent bundna DNA-proteinkomplex kommer att vara vid fasgränsen. Således är de regioner av genomet som är associerade med regulatorisk aktivitet och fria från nukleosomer (eller med ett litet antal av dem) belägna ovanför fasgränsen i vatten. De kan extraheras därifrån, återigen renas från de återstående proteinerna med fenol-kloroform, behandlas med ribonukleas A och återutfällas för vidare analys. Som kontroll används ett DNA-prov erhållet från samma vävnadskultur med samma förfaranden, men utan formaldehydfixering [6] .
Beroende på analysmetoden för de erhållna DNA-sektionerna, FAIRE-seq (höggenomströmningssekvensering av DNA-fragment, till exempel med Illumina ), FAIRE-chip (hybridisering av fluorescensmärkta DNA-fragment med DNA-mikroarrayer ), FAIRE-qPCR (kvantitativ analys av DNA-snitt med PCR i realtid ). Nu har FAIRE-seq nästan helt ersatt andra metoder för att bestämma extraherade DNA-fragment [6] .
Analysen av sekvenseringsdata kräver anpassning av sekvenser med referensgenomet, för vilket till exempel Bowtie används . Sedan genomsöks betydande anrikningsregioner . För dessa ändamål rekommenderas användning av ZINBA. Till skillnad från FAIRE-chip och FAIRE-qPCR, när man använder FAIRE-seq med tillräckligt djup av täckning av genomet, kan kontrollprovet saknas [6] .
Med FAIRE-seq kan man söka efter målpromotorer för tumörfaktorer, detektera och testa potentiella regioner av fritt kromatin som inte är associerade med nukleosomer, identifiera inducerbara regulatoriska regioner av genomet och beskriva aktiva regulatoriska element i genomet. Metoden gör det också möjligt att bedöma variationen i nukleotidsammansättningen av regulatoriska regioner i olika populationer [7] .
Användningen av FAIRE-seq i kombination med andra metoder, såsom DNase-seq, ger ett mer tillförlitligt och högkvalitativt resultat [2] .
FAIRE-metoden kräver ingen förbehandling av celler, eftersom formaldehyd tillsätts till näringsmediet eller direkt till vävnaden, vilket snabbt leder till celldöd, vilket gör det möjligt att erhålla kromatin i ett tillstånd före fixering. Samtidigt ger olika fixeringstider med formaldehyd vid konstant koncentration samma resultat. Till skillnad från ChIP [8] är metoden inte beroende av antikropparnas tillförlitlighet och variabilitet. Dessutom kräver FAIRE inte användning av enzymer som DNase eller MNase, som vanligtvis används i liknande metoder för att detektera nukleosomfria regioner. Frånvaron av enzymatisk behandling gör denna metod mindre variabel, mer tillförlitlig och reproducerbar [6] .
FAIRE är lätt att anpassa för användning på vävnadsprover eftersom FAIRE inte kräver en enda cellsuspension eller kärnisolering. I det här fallet är det enda ytterligare steget att mala den frusna vävnaden till ett grovt pulver innan fixering [6] .
FAIRE kan detektera distala regulatoriska element belägna långt från promotorer (t.ex. transkriptionella förstärkare) som inte finns i DNase-seq [2] .
Trots enkelheten i den experimentella delen kräver FAIRE-seq, liksom andra metoder förknippade med omfattande sekvensering, en betydande mängd beräkningsresurser och minne för att tolka resultaten. I detta avseende kan FAIRE-chip och FAIRE-qPCR vara mer attraktiva [6] .
Jämfört med DNase-seq och ChIP-seq har FAIRE ett lägre signal-brusförhållande. Därför kan platser som upptäckts av FAIRE endast skilja sig något från bakgrundssignalen från tid till annan, vilket minskar förtroendet för de identifierade platserna. Denna effekt förvärras när icke-sekvenserande detektionsmetoder används. Trots det låga signal-brusförhållandet är det värt att notera att FAIRE-resultaten har god reproducerbarhet . Detektionen av vissa promotorer av aktivt uttryckta gener är dock värre än andra metoder som DNase-seq [2] .
Effektiviteten av vävnadsfixering varierar beroende på dess egenskaper (renhet, permeabilitet, celldensitet, fetthalt och ytarea), vilket kan göra det svårt att jämföra resultat som erhållits för olika vävnader [6] .
FAIRE-seq mänskliga genomdata är tillgängliga som en del av ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements)-projektet på den interaktiva UCSC Genome Browser- webbplatsen som erbjuder tillgång till genomdata för olika ryggradsdjur , ryggradslösa och stora modellorganismer , integrerad med en stor samling av konsekventa anteckningar [9] .