PBR322

pBR322 är en plasmid som används i E. coli- bakterier som en kloningsvektor . Skapad 1977 av mexikanska biologer Francisco Bolivaroch Raymond Rodriguez [1] .

pBR322 innehåller 4361 nukleotidpar [ 2] och består av ori- replikationsstället (taget från plasmiden pMB1); amp R -gen som kodar för ett protein som ger resistens mot ampicillin (tagen från plasmid RSF2124och tetR - genen som ger resistens mot tetracyklin (tagen från plasmiden pSC101).). Plasmiden innehåller unika restriktionsställen för över 40 restriktionsenzymer . Av dessa 40 ställen är 11 inom tetR - genen , med 2 ställen ( HindIIIoch Clal) är belägna inom promotorn för denna gen. 6 platser är inom ampR - genen . ori replikeringsplats, lånad från plasmiden pMB1, har liknande struktur som ColE1 [3] . Det kodar för två RNA (RNAI och RNAII) och ett protein (Rom eller Rop).

Molekylvikten för plasmiden är 2,83⋅10 6 dalton [4] .

Koden i GenBank-databasen är J01749 [5] .

Numreringen av nukleotidpar startas vanligtvis från den centrala linjen av det unika EcoRI-restriktionsstället i riktning mot tet -genen . Ampicillinresistensgenen är penicillinbeta - laktamas med P1- och P3-promotorer .  P3 är en naturlig promotor, medan P1 skapas artificiellt genom ligering av två olika DNA-fragment. P2-promotom liknar P1, men är belägen på motsatt sida av plasmiden och initierar transkription i riktning mot tetracyklinresistensgenen [5] .

Skapande historia

1975 när Francisco Bolivarbörjade arbeta vid University of California i San Francisco som en del av Herbert Boyer- gruppen , var verktygen tillgängliga för molekylärbiologer extremt dåliga. Kloningsvektorer hade en mycket hög molekylvikt, deras egenskaper var dåligt förstådda och det fanns inga lämpliga kloningsställen [6] .

Boyers grupp, som inkluderade flera duktiga biologer, klonade och studerade några specifika gener. Arbetet fortskred dock extremt långsamt på grund av bristen på praktiska verktyg, främst kloningsvektorer, samt tillräckligt rena restriktionsendonukleaser och T4 DNA-ligas. Med tiden kom några medlemmar i gruppen på idén att skapa en mer avancerad verktygslåda.

Till en början godkände Boyer inte sina kollegors aktiviteter, och det mesta av arbetet måste göras efter arbetstid. Men när pBR322-plasmiden skapades blev han en aktiv supporter och promotor för det nya verktyget, och ersatte det med den tidigare använda plasmiden pMB9. Den nya plasmiden spreds snabbt över hela forskarsamhället, under de första dagarna togs den emot av mer än 300 laboratorier runt om i världen. Den ursprungliga metoden för kloning genom att deaktivera antibiotikaresistensgener gjorde det enkelt att planera experiment och snabbt analysera de data som erhölls.

På den tiden ansågs biosäkerhetsfrågor vara extremt pressande, så plasmiden skapades med starkt begränsad distribution utanför laboratoriet. Det blev den första vektorn av EK2-typ som certifierades av National Institutes of Health.som uppfyller säkerhetskraven för rekombinant DNA.

Slutligen bidrog avkodningen och publiceringen av dess nukleotidsekvens 1979 av Greg  Sutcliffe från Walter Gilberts laboratorium [7] i hög grad till populariteten för den nya plasmiden [7] .

I decennier har pBR322 använts aktivt i genforskning. Dess kodsekvens och genfunktioner var så väl studerade att de började användas som komponenter i skapandet av nya instrumentella plasmider.

Den ursprungliga artikeln i Gene [1] som beskriver skapandet av plasmiden blev en av de mest citerade artiklarna inom molekylärbiologi på 1970-talet och början av 1980-talet [8] .

Plasmidstruktur

Nukleotidsekvens

Nukleotidsekvensen för pBR322 är som följer [5]

Gener

Informationskälla [9] .

Restriktionswebbplatser

Unika webbplatser är markerade med fetstil [9] .

Plasmid pBR322 i populärkultur

Enligt Michael Crichtons Jurassic Park används delar av pBR322-plasmiden för att återskapa dinosaurie-DNA [10] . Även om namnet på själva plasmiden inte nämns på sidorna i boken, anges en nukleotidsekvens där, som enligt handlingen är ett fragment av det återställda dinosaurie-DNA. En sökning i GenBank-databasen med hjälp av BLASTN- sökmotorn hittar ett stort antal matchningar till pBR322-gensekvensen.

Se även

• Vektor (biologi) #DNA-kloningsexempel

Länkar

• Översikt
• ETHZ/Biologi/Lab
• Restriktionskartor. pBR322 .
• Bakteriella vektorer >> pBR 322 plasmider .
• J. Gregor Sutcliffe. Sekvensen av pBR322  (odefinierad)  // Aktuellt innehåll. - 17 december 1990. - T. 51 . - S. 22 .

Anteckningar

1. ↑ 1 2 Bolivar F., Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW, Crosa JH, Falkow S. Konstruktion och karaktärisering av nya kloningsfordon. II.  Ett mångsidigt kloningssystem //  Gene : journal. - Elsevier , 1977. - Vol. 2 , nr. 2 . - S. 95-113 . — PMID 344137 .
2. ↑ Watson , N. En ny revision av sekvensen för plasmid pBR322  //  Gene. - Elsevier , 1988. - Vol. 70 , nej. 2 . - s. 399-403 . - doi : 10.1016/0378-1119(88)90212-0 . — PMID 3063608 .
3. ↑ Qiagen Plasmid Resource Center. Tillväxt av bakteriekulturer (länk ej tillgänglig) . Arkiverad från originalet den 16 oktober 2005. (obestämd) 
4. ↑ pBR322 Vector Arkiverad 13 oktober 2010. .
5. ↑ 1 2 3 pBR322 Nucleotide Sequences, NCBI Sequence Viewer v2.0 . (obestämd)
6. ↑ Allt material i detta avsnitt, förutom stycken där källan specifikt anges, är hämtat från en artikel av Francisco Bolivar Zapata. Multipurpose Tools in Molecular Biology  (neopr.)  // Aktuellt innehåll. - 19 november 1990. - T. 47 . - S. 12 .
7. ↑ Sutcliffe JG (1979) Komplett nukleotidsekvens av Escherichia coli-plasmiden pBR322 . Cold Spring Harbor Symp. kvant. Biol. 43 : 77-80, PMID 383387 .
8. ↑ Garfield E. (1 oktober 1984) De mest citerade artiklarna 1961-1982. 4. 100 ytterligare Citation Classics . Aktuellt innehåll, 40 : 3-9.
9. ↑ 12 begränsningskartor . pBR322 Arkiverad från originalet den 26 juni 2011. .
10. ↑ Mark Boguski. En molekylärbiolog besöker Jurassic  Park //  Biotechniques : journal. - 1992. - Vol. 12 . - s. 668-669 . Arkiverad från originalet den 20 november 2008.