Fluorescensanisotropi

Fluorescensanisotropi (fluorescenspolarisation ) är  ett fysiskt fenomen som består av olika ljusintensiteter som emitteras av en fluorofor längs olika polarisationsaxlar . Pionjärer för forskning inom detta vetenskapsområde var Alexander Yablonsky , Gregorio Weber [1] och Andreas Albrecht [2] . Metoder baserade på analys av fluorescenspolarisation används i stor utsträckning vid screening av föreningar med låg molekylviktinteragerar med proteiner och i studiet av proteiners struktur.

Metodprincip

Fenomenet fluorescens är baserat på övergången av en molekyl till ett exciterat tillstånd vid absorption av en foton . Efter en kort fördröjning (den karakteristiska fluorescenstiden τ ), återgår molekylen tillbaka till grundtillståndet och ger upp en del av energin i form av värme och avger ytterligare en foton. Under dessa händelser omfördelas molekylens elektroner . I detta avseende är excitation av en foton möjlig endast med en viss orientering av ljusets elektriska fältvektor relativt molekylen, och den emitterade fotonen är polariserad på ett visst sätt i förhållande till molekylen.

Om en grupp av fluoroforer belyses med polariserat ljus, kommer molekylerna som är orienterade i ett visst intervall av vinklar i förhållande till polarisationsplanet att gå in i det exciterade tillståndet. Om de är stationära kommer även det utsända ljuset att polariseras i en viss vinkel. Denna inneboende anisotropi ( r 0 ) mäts vanligtvis genom att inkorporera fluoroforer i en frusen flervärd alkohol .

Graden av polarisering av det emitterade ljuset kan minskas om fluoroforerna är fria att rotera. Graden av minskning av korrelationen mellan polariseringen av absorberat och emitterat ljus beror på förhållandet mellan den karakteristiska ändringstiden i den rumsliga orienteringen av fluoroforen ϕ och den karakteristiska fluorescenstiden τ . Orsaken till förändringen i orienteringen av fluoroforen kan vara antingen rotationen av hela molekylen eller rotationen av endast dess fragment som innehåller fluoroforen. Måttet på anisotropi är relaterat till rotationshastigheten genom följande relation:

,

där r  är den observerade anisotropin, r0 är den inneboende  anisotropin för molekylen, τ  är den karakteristiska fluorescenstiden och ϕ  är den karakteristiska rotationstiden.

Sådana resonemang är endast tillämpliga när fluoroforerna är tillräckligt långt ifrån varandra. Om de är i närheten kan de utbyta energi på grund av Förster-resonans ( eng.  FRET ), vilket leder till en minskning av den observerade anisotropin eller till en starkare minskning av korrelationen. Denna implementering av FRET kallas emFRET (energy migration FRET).

Applikation

Fluorescensanisotropi kan användas för att bestämma bindningskonstanter eller studera kinetiken för reaktioner åtföljda av förändringar i molekylernas rotationstider. Till exempel, om en fluorofor är fäst vid en liten molekyl, kan dess rotationshastighet reduceras avsevärt när den binder till ett protein. Om fluoroforen är fäst vid en större molekyl kommer skillnaden i polarisation mellan det fria och det bundna tillståndet att bli mindre (inklusive på grund av den initiala låga rotationshastigheten för den stora molekylen), vilket kommer att leda till en minskning av mätnoggrannheten. Graden av bindning bestäms av förändringen i anisotropi mellan fria, delvis bundna och helt bundna (i överskott av protein) tillstånd genom titrering .

Om fluoroforen är fäst vid en stor molekyl som ett protein eller RNA , kan dess förändring i rörlighet under veckning användas för att studera veckningsdynamik.

I mikroskopi kan fenomenet fluorescenspolarisering användas för att studera den lokala viskositeten hos cytosolen eller membranen , för att bestämma den lokala mikrostrukturen hos membran eller lipidsammansättningen . Detta använder polarisatorer placerade efter ljuskällan och framför kameran. Denna teknik kan också användas för att studera interaktionen mellan molekyler i signalkaskader som svar på olika influenser.

EmFRET-fenomenet och den associerade minskningen av anisotropi kan användas i studien av .

Anteckningar

  1. ↑ Weber, G., 1953. Roterande Brownsk rörelse och polarisering av fluorescensen av lösningar. Adv. proteinkem. 8:415-459
  2. ↑ Albrecht, A., 1961. Polariseringar och tilldelningar av övergångar: metoden för fotoselektion. J. Mol. Spectrosc. 6:84-108.

Litteratur