Omvänd faskromatografi

Omvänd fas (omvänd fas) kromatografi (RPC) är en variant av kromatografi där den stationära fasen är opolär [1] . Denna variant av kromatografi hänvisar till vätskekromatografi (i motsats till gaskromatografi).

Termen "omvänd fas" har en historisk bakgrund. På 1970-talet använde vätskekromatografi i de flesta fall en fast stationär fas (även kallad " kolonn ") som innehöll omodifierade kisel- eller aluminiumfyllmedel. Idag är denna metod känd som "normalfaskromatografi". I fallet med normalfaskromatografi är den stationära fasen hydrofil (den har hög affinitet för hydrofila molekyler i den mobila fasen). Därför tenderar hydrofila molekyler i den mobila fasen att binda ( adsorberas ) på kolonnen, medan hydrofoba sådana.molekyler passerar genom kolonnen och elueras först. Vid normalfaskromatografi kan hydrofila molekyler elueras från kolonnen genom att öka polariteten hos den mobila faslösningen.

Tillkomsten av metoder som använder alkylkedjor kovalent bundna till en fast bas gjorde det möjligt att skapa en hydrofob stationär fas med en stark affinitet för hydrofoba föreningar. Användningen av en hydrofob stationär fas kan ses som motsatsen eller "omvänd" till normalfaskromatografi - därav termen "omvänd faskromatografi" [2] [3] . Omvänd faskromatografi använder en polär (vattenhaltig) mobil fas. Som ett resultat adsorberas hydrofoba molekyler i den polära mobila fasen på den hydrofoba stationära fasen, medan hydrofila molekyler i den mobila fasen kommer att passera genom kolonnen och elueras först [2] [4] . Hydrofoba molekyler kan elueras från kolonnen genom att minska polariteten hos den mobila fasen med hjälp av organiska (icke-polära) lösningsmedel som reducerar hydrofoba interaktioner. Ju mer hydrofob en molekyl är, desto mer kommer den att binda till den stationära fasen och desto högre koncentration av organiskt lösningsmedel som kommer att krävas för att eluera den molekylen.

Många av de matematiska och experimentella antagandena som används i andra kromatografiska metoder gäller också i OFC (t.ex. "separationsupplösning" beror på kolumnlängden). Det kan också användas för att separera många typer av molekyler. Denna metod används inte vanligtvis för att separera proteiner eftersom de organiska lösningsmedlen som används kan denaturera de flesta proteiner. Därför är i detta fall normalfaskromatografi en mer acceptabel metod.

Idag används OFC ofta i analytiska syften. Det finns ett antal olika stationära faser för RPC, vilket ger större flexibilitet i valet av separationsmetoder.

Stationär (stationär) fas

Tabell 1. Huvudsakliga stationära faser som används i omvänd fas HPLC [5] [6] .
Beteckning Beskrivning Strukturera
Cl, TMS, SAS, trimetyl Den har hög selektivitet vid separation av polära föreningar och föreningar med ett stort antal funktionella grupper. Den behåller föreningar med alkylgrupper minst av allt i opolära lösningsmedel.
C2, RP-2, dimetyl Den har en högre retention än C1 och mindre än C4, C8 och C18.
C3, Propyl Används vid hydrofob interaktionskromatografi ( HIC ) av peptider och proteiner.
C4, Butyl Tillämplig för HIC och jonparkromatografi. I opolära lösningsmedel har det en lägre retention än C8- och C18-faserna. Detta material med en pordiameter på 300 Å är idealiskt för analys av stora proteiner och hydrofoba peptider.
C5, Pentil Med en pordiameter på 300Å används den för omvänd fasseparation av hydrofoba proteiner och peptider. Mer motståndskraftig mot hydrolys än C4.
C6, Hexyl Används för jonparkromatografi. Har lägre retention än C8 och C18.
C8, MOS, RP-8, LC8, Octyl Den är nära C18 i selektivitet, men har en lägre retention. Används i stor utsträckning vid analys av läkemedel, nukleotider, steroider, etc. Med en pordiameter på 300Å är detta material väl lämpat för separation av peptider och små hydrofila proteiner.
C12, Dodecyl På grund av den kortare kolkedjan än C18 ger den bra interaktion och skarpare toppform för opolära och måttligt polära föreningar.
C18, ODS, RP-18, LC-18, Octadecyl Det klassiska omvändfasmaterialet med högsta retention i opolära lösningsmedel. Fungerar utmärkt i jonparkromatografi. Det har det bredaste användningsområdet (separation av peptider, nukleosider, nukleotider, steroider, läkemedel, vitaminer, fettsyror, bekämpningsmedel, etc.). Med en pordiameter på 300Å används detta material för att separera små hydrofoba peptider.
C6H5 , Fenyl _ _ Den har en unik selektivitet och används för att separera aromatiska föreningar. Med en pordiameter på 300Å används detta material för HIC.
C6H5 ( C3H6O - linker ) , fenyleter _ _ Används för att separera högpolära aromater. Skiljer sig i selektivitet från fenyl- och fenylhexylfaser.
C6H5 ( C6H12 - linker ) , Fenyl - hexyl Den har samma selektivitet som fenylfasen, men med mycket större stabilitet.
C6F5 , PFP _ _ Används för analys av substituerade aromatiska föreningar. Skiljer sig i selektivitet från fenyl-hexyl-, klassiska fenyl- och alkylfaser.
CN, CPS, PCN, cyano, cyanopropyl, nitril Kan användas som omvänd fas eller normalfasmaterial. Eftersom den är något polär har denna fas utmärkt selektivitet vid separation av polära föreningar. Dessutom är den snabbt balanserad, vilket är en värdefull egenskap när man arbetar .

i gradientelueringsläge. Används för analys av olika läkemedel (till exempel antidepressiva medel, etc.)

NH2 , APS , amino, aminopropylsilyl Kan användas för omvänd fas, normal fas och jonbyteskromatografi (svag anjonbytare). Används i omvänd faskromatografi för att separera kolhydrater.
OH, Diol, glycerol Kan användas som omvänd fas eller normalfasmaterial. När den fungerar som en omvänd fas används den i gelfiltreringskromatografi (GFC) av peptider och proteiner.

Mobilfas

För att eluera analyter från en kolonn med omvänd fas används blandningar av vatten eller vattenhaltiga buffertlösningar och organiska lösningsmedel [2] . Organiska lösningsmedel måste vara blandbara med vatten. De vanligaste är acetonitril , metanol och tetrahydrofuran (THF). Det är också möjligt att använda etanol eller isopropanol . Eluering kan utföras isokratiskt (blandningen av vatten och organiskt lösningsmedel ändras inte i procent under hela separationsprocessen), eller med hjälp av en gradient (förhållandet vatten-organiskt lösningsmedel ändras under processen, vanligtvis i riktning mot minskande polaritet). Den mobila fasens pH-värde kan ha ett stort inflytande på separationen av blandningen och kan även förändra analysens selektivitet (ordningen för frisättning av de analyserade föreningarna).

Laddade analyter kan separeras på en omvänd faskolonn med hjälp av jonpar (även: joninteraktion). Denna teknik är känd som "Reversed Phase Ion Pair Chromatography".

Anteckningar

  1. ↑ IUPAC Gold Book internetupplaga: " reversed-phase chromatography ".
  2. ↑ 1 2 3 Akul Mehta. Principen för omvänd faskromatografi HPLC/UPLC (med animering  ) . PharmaXChange (27 december 2012). Hämtad 10 januari 2013. Arkiverad från originalet 15 april 2013.
  3. ↑ I Molnár och C Horvath. Omvänd faskromatografi av polära biologiska ämnen: separation av katekolföreningar genom högpresterande vätskekromatografi  (engelska)  // Clinical Chemistry : journal. - 1976. - September ( vol. 22 , nr 9 ). - P. 1497-1502 . — PMID 8221 .
  4. ↑ (Clinical Biochemistry, TWHrubey, 54)
  5. ↑ Fenomenex. HPLC-bundna faser . http://www.phenomenex.com . Hämtad 3 september 2017. Arkiverad från originalet 3 september 2017.
  6. ↑ Aquilon. En kort guide till HPLC . www.akvilon.su _

Länkar

  Gå till Wikidata-objektet  Ordböcker och uppslagsverk