Enzymatisk promiskuitet är förmågan hos ett enzym att katalysera en slumpmässig sidoreaktion utöver dess huvudreaktion. Även om enzymer är extremt specifika katalysatorer kan de ofta utföra sidoreaktioner utöver sin primära naturliga katalytiska aktivitet [1] . Enzymets sidoaktivitet går vanligtvis långsammare jämfört med huvudaktiviteten och är under neutralt urval. Även om dessa aktiviteter normalt är fysiologiskt irrelevanta, under nya selektiva påtryckningar, kan dessa aktiviteter vara fördelaktiga, och därigenom få utvecklingen av tidigare sekundära aktiviteter att bli den nya primära aktiviteten [2] . Ett exempel på detta är atrazinklorhydrolaset ( kodas av atzA ) från Pseudomonas sp. , härlett från melamindeaminas (kodas av triA ) , som har mycket liten sidoaktivitet på atrazin, en mänskligt tillverkad kemikalie [3] .
Enzymer utvecklas för att katalysera en specifik reaktion på ett specifikt substrat med hög katalytisk effektivitet ( k cat /KM , se även Michaelis-Menten kinetik ). Men förutom denna huvudaktivitet har de sekundära aktiviteter, som vanligtvis är flera storleksordningar lägre i aktivitet, och som inte är resultatet av evolutionärt urval och därför inte deltar i organismens fysiologi. Detta fenomen tillåter enzymer att ta på sig nya funktioner, eftersom sidoaktiviteter kan dra nytta av nya selektionstryck som leder till duplicering av genen som kodar för enzymet och selektion av sidoaktiviteten som den nya primära aktiviteten.
Det finns flera teoretiska modeller för att förutsäga ordningen för duplicering och förändring av specialisering, men själva processen är mer invecklad och flummig (§ Rekonstruerade enzymer nedan) [4] . Å ena sidan leder genamplifiering till en ökning av enzymkoncentrationen och potentiell frihet från restriktiv reglering, vilket följaktligen ökar reaktionshastigheten ( v ) för enzymets sidoaktivitet, vilket gör dess effekter mer uttalade fysiologiskt (”gendosering) effekt”) [5] . Å andra sidan kan enzymer utveckla ökad sekundär aktivitet med liten förlust av primär aktivitet ("stabilitet") med liten adaptiv konflikt (§ Stabilitet och plasticitet nedan) [6] .
En studie av fyra olika hydrolaser (humant serumparaoxonas (PON1), pseudomonadfosfotriesteras (PTE), proteintyrosinfosfatas (PTP) och humant kolanhydras II (CAII)) visade att deras huvudsakliga aktivitet är "resistent" mot förändring, medan sidoaktiviteter är "svagare och mer flexibla. Särskilt valet av sidoaktiviteter, (genom riktad evolution), minskar initialt inte enzymets huvudaktivitet (därav dess "stabilitet"), men påverkar i hög grad sidoaktiviteterna (därav deras "plasticitet") [6] .
Fosfotriesteras (PTE) från Pseudomonas diminuta utvecklades till att bli 10enarylesteras (hydrolas P-O till C-O) i arton cykler, medett [7] .
Detta innebär för det första att ett specialiserat enzym (monofunktionellt) i evolutionsprocessen passerar genom ett universellt stadium (multifunktionellt) innan det blir specialiserat igen - förmodligen efter genduplicering enligt IAD-modellen - och för det andra är sidoaktiviteterna mer plastiska, skiljer sig från huvudverksamheten.
Det senaste och mest slående exemplet på utvecklingen av enzymer är uppkomsten av biologiskt reparerande enzymer under de senaste 60 åren. På grund av det mycket lilla antalet aminosyrasubstitutioner ger de en utmärkt modell för att studera utvecklingen av enzymer i naturen. Att använda befintliga enzymer för att bestämma hur en enzymfamilj utvecklats har dock nackdelen att ett nyutvecklat enzym jämförs med paraloger , utan att veta den sanna identiteten av förfadern innan de två generna divergerar. Detta problem kan lösas tack vare rekonstruktionen av förfäderna. Först föreslog 1963 av Linus Pauling och Emil Zuckerkandl, förfäders rekonstruktion är härledningen och syntesen av en gen från förfädernas form av en grupp gener [8] som nyligen har återupplivats genom förbättrade slutledningstekniker [9] och billiga konstgjorda gensyntes [10] vilket resulterar i behovet av att studera flera förfäders enzymer, som vissa refererar till som "stamzymer" [11] [12] .
Bevis som erhållits med det omformade enzymet tyder på att händelseordningen när ny aktivitet förbättras och en gen dupliceras inte är entydig, i motsats till vad teoretiska modeller för genutveckling skulle antyda.
En studie visade att den förfäders genen från immunförsvarsproteasfamiljen från däggdjur hade bredare specificitet och högre katalytisk effektivitet än den moderna paralogfamiljen [11], medan en annan studie visade att den förfäders ryggradssteroidreceptorn var en östrogenreceptor med liten substrattvetydighet för andra . hormoner, vilket indikerar att de förmodligen inte syntetiserades vid den tiden [13] .
Denna variation i ärftlig specificitet har observerats inte bara mellan olika gener, utan också inom samma genfamilj. I ljuset av det stora antalet paraloga svamp-a-glukosidasgener med ett antal specifika maltosliknande (maltos, turanos, maltotrios, maltulos och sackaros) och isomaltosliknande (isomaltos och palatinos) substrat, rekonstruerade studien alla viktiga förfäder och fann att den sista gemensamma förfadern till paralogerna mestadels var aktiv på maltosliknande substrat med endast spåraktivitet för isomaltosliknande sockerarter, även om det ledde till en rad isomaltosglukosidaser och en linje som ytterligare klyvdes till maltosglukosidaser och isomaltosglukosidaser. Däremot hade förfadern före den sista klyvningen en mer uttalad isomaltosliknande glukosidasaktivitet [4] .
Roy Jensen föreslog 1976 att primära enzymer måste vara mycket promiskuösa för att metabola nätverk ska kunna samlas på ett lapptäckesätt (därav dess namn, lapptäckemodellen ). Denna ursprungliga katalytiska mångsidighet gick senare förlorad till förmån för högkatalytiska specialiserade ortologa enzymer. [14] Som en konsekvens har många enzymer av central metabolism strukturella homologer som divergerade före uppkomsten av den sista universella gemensamma förfadern [15] .
Promiskuitet är inte bara en primordial egenskap, utan en mycket vanlig egenskap i moderna genom. Ett antal experiment utfördes för att utvärdera fördelningen av promiskuitetsenzymaktivitet i E. coli . I E. coli kunde 21 av 104 testade enstaka gener (från Keio-samlingen [16] ) elimineras genom att överuttrycka ett icke-kognat E. coli-protein (med användning av en poolad uppsättning plasmider från ASKA-samlingen [17] ). Mekanismerna genom vilka en icke-kognat ORF kan återställa knockout kan grupperas i åtta kategorier: isoenzymöveruttryck (homologer), substrattvetydighet, transportambiguitet (rening), katalytisk promiskuitet, upprätthållande av metaboliskt flöde (inklusive överuttryck av en stor syntaskomponent i frånvaron av en aminotransferassubenhet), bypass, regulatoriska effekter och okända mekanismer [5] . På samma sätt tillät överuttryck av ORF-samlingen E. coli att öka resistensen med mer än en storleksordning i 86 av 237 toxiska miljöer [18] .
Det är känt att homologer ibland är promiskuösa i förhållande till varandras grundläggande reaktioner [19] . Denna korspromiskuitet studeras mest med medlemmar av superfamiljen alkaliska fosfataser , som katalyserar den hydrolytiska reaktionen vid sulfat-, fosfonat-, monofosfat-, difosfat- eller trifosfatesterbindningen av flera föreningar [20] . Trots divergensen har homologer olika grader av ömsesidig promiskuitet: skillnader i promiskuitet är relaterade till de inblandade mekanismerna, särskilt den nödvändiga intermediären [20] .
Enzymer tenderar att vara i ett tillstånd som inte bara är en avvägning mellan stabilitet och katalytisk effektivitet, utan detta gäller även specificitet och evolverbarhet, där de två sistnämnda avgör om ett enzym är mångsidigt (högt utvecklat på grund av stor promiskuitet, men låg huvudaktivitet) eller speciell (hög huvudaktivitet, dåligt utvecklad på grund av hög förståelighet) [21] . Exempel är enzymer för primär och sekundär metabolism i växter (§ Sekundär växtmetabolism nedan). Andra faktorer kan spela in, till exempel visar glycerofosfodiesteras ( gpdQ ) från Enterobacter aerogenes olika värden på sin promiskuösa aktivitet beroende på de två metalljoner den binder, vilket dikteras av jontillgänglighet [22] .v I vissa fall, promiskuitet kan ökas genom att försvaga specificiteten för det aktiva stället genom att öka det med en enda mutation, vilket var fallet för D297G-mutanten av E. coli L-Ala-D/L-Glu- epimeras (ycjG ) och E323G-laktoniserande enzym II mutant av Pseudomonas muconate, vilket tillåter dem att slumpmässigt katalysera aktivitet O-succinylbensoatsyntas ( menC ) [23] . Omvänt kan promiskuiteten minskas, vilket var fallet för γ-humulensyntas (sesquiterpensyntas) från Abies grandis, som är känt för att producera 52 olika seskviterpener från farnesyldifosfat efter flera mutationer [24] .
Studier på enzymer med bred specificitet – inte promiskuösa, men begreppsmässigt relaterade – såsom trypsin och kymotrypsin från däggdjur och det bifunktionella isopropylmalat-isomeraset/homoakonitaset från Pyrococcus horikoshii har visat att öglemobilitet i aktiva ställen i hög grad bidrar till den katalytiska elasticiteten hos enzymet [25 ] 26] .
Promiskuitetsaktivitet är en icke-nativ aktivitet för vilken enzymet inte har utvecklats, som härrör från den ackommoderande konformationen av det aktiva stället. Enzymets huvudsakliga aktivitet är dock inte bara resultatet av selektion mot en hög katalytisk hastighet med avseende på ett visst substrat för att erhålla en viss produkt, utan också för att undvika bildning av toxiska eller oönskade produkter [2] . Till exempel, om tRNA-syntes laddar in fel aminosyra i tRNA, kommer den resulterande peptiden att ha oväntat förändrade egenskaper, varför flera ytterligare domäner finns närvarande för att förbättra noggrannheten [27] . I likhet med tRNA-syntesreaktionen adenylerar den första tyrecidinsyntetas ( tyrA ) subenheten från Bacillus brevis fenylalaninmolekylen för att använda adenyldelen som hävstång för att producera tyrokidin, en cyklisk icke- ribosomal peptid . När enzymets specificitet undersöktes visade det sig ha hög selektivitet för naturliga aminosyror som inte är fenylalanin, men mycket mer toleranta mot icke-naturliga aminosyror [28] . I synnerhet katalyserades de flesta aminosyror inte, medan den näst mest katalyserade naturliga aminosyran var tyrosin i strukturen, men en tusendel mer än fenylalanin, medan flera icke-kodande aminosyror katalyserade bättre än tyrosin, nämligen D-fenylalanin, β-cyklohexyl - L-alanin, 4-amino-L-fenylalanin och L-norleucin [28] .
Ett specifikt fall av vald sekundär aktivitet är restriktionspolymeraserna och endonukleaserna, där den felaktiga aktiviteten i själva verket är resultatet av en kompromiss mellan noggrannhet och evolverbarhet. Till exempel, för restriktionsendonukleaser, är felaktig aktivitet ( stjärnaktivitet ) ofta dödlig för organismen, men en liten mängd av denna aktivitet tillåter utvecklingen av nya funktioner för att motverka patogener [29] .
Växter producerar ett stort antal sekundära metaboliter på grund av enzymer som, till skillnad från de som är involverade i primär metabolism, är mindre katalytiskt effektiva, men har större mekanisk elasticitet (typer av reaktioner) och bredare specificitet. Den liberala drifttröskeln (orsakad av lågt urvalstryck på grund av liten populationsstorlek) tillåter konditionsvinsten från ett livsmedel att stödja andra aktiviteter, även om de kan vara fysiologiskt värdelösa [30] .
I biokatalys söker de efter många reaktioner som inte finns i naturen. För detta identifieras och utvecklas enzymer med liten promiskuös aktivitet i förhållande till den önskade reaktionen genom riktad evolution eller rationell design [31] .
Ett exempel på ett brett utvecklat enzym är ω-transaminas, som kan ersätta en keton med en kiral amin [32] och därför finns bibliotek av olika homologer kommersiellt tillgängliga för snabb biomining (t.ex. Codexis ).
Ett annat exempel är möjligheten att använda den slumpmässiga aktiviteten av cysteinsyntas ( cysM ) mot nukleofiler för att erhålla icke-proteinogena aminosyror [33] .
Likheten mellan enzymatiska reaktioner ( EC ) kan beräknas med hjälp av länkförändringar, reaktionscentra eller substrukturpoäng ( EC-BLAST ) [34] .
Medan promiskuitet mestadels studeras i termer av standardenzymkinetik, är läkemedelsbindning och deras efterföljande reaktion en promiskuös aktivitet eftersom enzymet katalyserar en inaktiveringsreaktion mot ett nytt substrat som det inte har utvecklats för att katalysera [6] . Detta kan bero på det faktum att proteiner endast har ett litet antal distinkta ligandbindningsställen.
Å andra sidan har metabolismen av xenobiotika från däggdjur designats för att ha en bred specificitet för att oxidera, binda och ta bort främmande lipofila föreningar som kan vara giftiga, såsom växtalkaloider, så deras förmåga att avgifta antropogena xenobiotika är en förlängning av detta. [35] .
| Enzymer | |
|---|---|
| Aktivitet | |
| förordning | |
| Klassificering | |
| Typer |
|