Fluorescensmikroskopi är en metod för att erhålla en förstorad bild med hjälp av luminescensen av exciterade atomer och molekyler i ett prov. Används i stor utsträckning inom materialvetenskap och biomedicinska områden.
Molekyler är kapabla att absorbera ljuskvanta och övergå till elektroniskt exciterade tillstånd. Återgången av en molekyl till det "normala" (grund) tillståndet, åtföljd av ljusemission, kallas fluorescens . Absorption och fluorescens bestäms av strukturen av energinivåerna hos molekylens elektroner och är därför en specifik egenskap för varje typ av molekyl (se detaljer i artikeln elektronvibrationsspektroskopi ) .
Biologiskt material fluorescerar som regel mycket svagt av sig självt, men på grund av användningen av ljusa och olika fluorescerande molekyler ( fluoroforer ) som specifikt kan färga olika strukturer av vävnader och celler, har metoden med fluorescensmikroskopi visat sig vara mycket värdefull för biomedicinska vetenskaper.
Traditionella metoder för fluorescensmikroskopi har en betydligt lägre upplösning jämfört med elektron- eller atomkraftsmikroskopi . Men till skillnad från det senare gör optisk mikroskopi det möjligt att observera den inre mikrostrukturen hos celler och till och med små organismer, inte bara fasta utan också levande. På grund av detta har fluorescensmikroskopi visat sig vara den bästa metoden för att studera mekanismerna för organismers funktion på cellulär, subcellulär och molekylär nivå.
I ett fluorescerande mikroskop bestrålas provet med ljus med en högre frekvens och bilden erhålls i det optiska spektrumet. Strålningen från provet leds genom ett filter som stänger av ljus vid excitationsfrekvensen. Bilden av det fluorescerande preparatet kan fotograferas med en specialiserad digitalkamera, vilket gör det möjligt att ta långa exponeringsfotografier. För vissa bilder kan denna tid vara upp till 60 minuter.
Den intensiva utvecklingen av fluorescensmikroskopi i början av 1900- och 2000-talet ledde till utvecklingen av nya metoder - tvåfoton- och konfokalmikroskopi , samt ett antal tillvägagångssätt som gjorde det möjligt att övervinna diffraktionsbarriären för optisk upplösning och uppnå oöverträffad nanorlösning.
En av typerna av fluorescensmikroskopi är konfokalmikroskopi , en metod som gör att man kan erhålla en bild av ett givet lager av ett prov, för att bli av med bidraget från lagren ovanför och under. Således har denna metod en jämförbar upplösning längs de tre koordinataxlarna. En annan typ av fluorescensmikroskopi, epifluorescensmikroskopi, låter dig undersöka provets yta och en smal ytnära zon.
Total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) är baserad på fenomenet elektromagnetisk vågreflektion från ett gränssnitt mellan två transparenta medier, som uppstår när en våg faller in från ett medium med ett högre brytningsindex vid en vinkel större än den kritiska vinkeln (1 ) /n). Intensiteten av strålningen som tränger in i det andra mediet avtar enligt en exponentiell lag, vilket gör det möjligt att detektera fluorescerande föremål som exciteras av denna strålning i ett ~100 nm tjockt gränsskikt med en upplösning på upp till 10 nm [1] . Således kan TIRFM med rätta anses vara en av metoderna för fluorescensnanoskopi. Inom biologin används metoden för att visualisera cellers plasmamembran och membranstrukturer.
Under de senaste åren har flera nya tillvägagångssätt utvecklats inom området fluorescensmikroskopi, som har gjort det möjligt att övervinna diffraktionsbarriären för optisk upplösning och uppnå mycket hög ~10 nm. Dessa metoder började förenas under den allmänna termen fluorescensnanoskopi.