Fluorescens nanoskopi

Fluorescensnanoskopi är en metod  för att detektera fluorescerande föremål med hjälp av ett optiskt mikroskop , som har en rumslig upplösning flera gånger högre än den teoretiska gränsen för optisk diffraktion (~200 nm).

Beskrivning

Under de senaste åren har flera nya tillvägagångssätt utvecklats inom området fluorescensmikroskopi, som har gjort det möjligt att övervinna diffraktionsbarriären för optisk upplösning och uppnå en oöverträffad upplösning på ~10 nm. Dessa metoder började förenas under den allmänna termen fluorescensnanoskopi.

Fluorescerande nanoskopisystem är baserade på tre fundamentalt olika tillvägagångssätt:

• förbättring av fokusering på grund av skapandet av nya optiska scheman och användningen av linser med en hög vinkelöppning (4Pi-, I5M- och I5S-mikroskopi);
• användning av fenomenet total intern reflektion (total intern reflektion fluorescensmikroskopi, TIRFM);
• kontrollerad "på" och "av" av fluorescerande molekyler och deras sekventiell detektering ( STED , GSD, SPEM ( SSIM ), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Flera tillämpningar av fluorescerande nanoskopiska tekniker inom biologi och medicin kan föreställas. Nanoskopi låter dig direkt studera interaktionerna mellan proteiner , DNA och RNA , och kan därför spela en betydande roll i utvecklingen av genomik och proteomik , i studiet av cellfysiologi, för att förstå de patofysiologiska mekanismer som är förknippade med nedsatt bildning av komplex proteinkomplex, etc. [1]

Dessa tillvägagångssätt diskuteras mer i detalj nedan:

• 4Pi och I5M är implementerade på basis av ett tvåobjektivt system, vilket förbättrar upplösningen längs den optiska axeln upp till 80 nm på grund av summeringen av två motsatta sfäriska ljusfronter vid brännpunkten. I5S har förbättrad upplösning i fokalplanet (upp till 100 nm).
• TIRFM gör det möjligt att detektera fluorescerande föremål i ett ~100 nm tjockt gränsskikt med en upplösning på upp till 10 nm.
• STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT. Absorptionen av ett ljuskvantum av en molekyl åtföljs av övergången av en elektron från markenerginivån (SO ) till en exciterad fluorescerande nivå (singlett Si eller triplett T1 ) . Absorption kan också inducera reversibla intramolekylära omarrangemang (till exempel cis-trans- isomerisering ), vilket resulterar i en förändring i fluorescensspektrumet . Vilken som helst av övergångarna S 0 → S 1 , S 0 → T 1 kan användas för att slå på/stänga av fluoroforer och öka upplösningen.

Sålunda är STED-mikroskopi (stimulated emission depletion) baserad på samtidig användning av två ljusstrålar - en fokuserad stråle som exciterar en fluorofor i den centrala zonen (S 0 → S 1 ), och en stråle som har formen bagel och släcks. fluoroforer runt den centrala zonen (S 1 → S 0 ). Således registreras fluorescens endast från munkhålet. Metodens upplösning bestäms av lagen där I s är den strålningseffekt som krävs för att säkerställa den föredragna övergången S 1 → S 0 ; I max är släckningsstrålningseffekten. Således visar sig upplösningen vara justerbar (beroende på källans effekt) och teoretiskt oändlig (vid I max /I s → ∞). I praktiken har ett tröskelvärde på ~10 nm uppnåtts, vilket motsvarar dimensionen av biologiska makromolekyler .

Mättad strukturerad belysningsmikroskopi (SSIM) eller mättad mönsterexcitationsmikroskopi (SPEM) bygger på en liknande princip . Ground state depletion (GSD)-mikroskopi implementerar en liknande princip, men släcker det exciterade tillståndet genom att överföra molekylen till ett längre livslängd T 1 - tillstånd. Slutligen är reversibel mättbar optisk fluorescerande övergångsmikroskopi (RESOLFT ), fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM) och stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM ) baserade på att slå på/stänga av fluoroforer på grund av deras fotokemiska isomerisering .

Analys av placeringen av fluoroforer i 3D-rymden utförs med dessa metoder på olika sätt. STED, GSD, SPEM/SSIM och RESOLFT använder optisk fokusering för att sekventiellt registrera en signal från givna rumsliga koordinater; PALM och STORM stänger av fluoroforer slumpmässigt och ackumulerar samtidigt signaler från påslagna fluoroforer på ett avstånd av .

Anteckningar

1. ↑ Peters R. Från fluorescensnanoskopi till nanoskopisk medicin // Nanomedicin. V. 3, 2008. S. 1–4.

Litteratur

• Hell SW Far-Field Optical Nanoscopy // Vetenskap. 2007. V. 316. S. 1153–1158.

Länkar