Kvantitativ analys av nukleinsyror - bestämning av koncentrationen av DNA eller RNA i en blandning eller ren beredning. Reaktioner som involverar nukleinsyror kräver ofta korrekt information om mängden och renheten av läkemedlet. För att bestämma koncentrationen av nukleinsyra i lösning används en spektrofotometrisk metod och UV-fluorescens om nukleinsyran innehåller ett färgämne.
Nukleinsyror absorberar ultraviolett ljus på ett visst sätt . I spektrofotometrar utsätts provet för ultraviolett ljus vid en våglängd på 260 nm, och en fotodetektor mäter mängden ljus som har passerat genom provet. Ju mer ljus som absorberas, desto högre koncentration av nukleinsyra i provet.
Genom att använda Bouguer-Lambert-Beers lag är det möjligt att korrelera koncentrationen av molekyler som absorberar strålning med mängden absorberat ljus. Vid en våglängd på 260 nm är den genomsnittliga extinktionskoefficienten för dubbelsträngat DNA 0,020 (μg/mL) −1 cm −1 , för enkelsträngat DNA 0,027 (μg/mL) −1 cm −1 , för enkelsträngat RNA 0,025 (μg/mL) −1 cm −1 och för korta enkelsträngade oligonukleotider beror extinktionskoefficienten på längden och förhållandet mellan kvävehaltiga baser (ca 0,030 (μg/mL) −1 cm −1 ). Följaktligen motsvarar den optiska densiteten ( eng. OD, optisk densitet ) lika med 1 en koncentration av dubbelsträngat DNA på cirka 50 µg/ml. Den spektrofotometriska metoden för att bestämma koncentrationen av nukleinsyror används vid koncentrationer upp till 2 OD. [1] Mer exakta extinktionskoefficienter krävs för att bestämma koncentrationen av oligonukleotider, och kan förutsägas med hjälp av den närmaste grannmodellen. [2]
| Nukleinsyratyp | Koncentration (µg/ml) för 1 enhet A 260 |
|---|---|
| dsDNA (dubbelsträngat DNA) | femtio |
| ssDNA (enkelsträngat DNA) | 37 |
| ssRNA (enkelsträngat RNA) | 40 |
För att bestämma provkoncentrationen måste den optiska densiteten som finns i en standardkyvett med en optisk bana på 10 mm multipliceras med lämplig koefficient. Till exempel motsvarar ett absorbansvärde på 0,9 optiska enheter av dubbelsträngat DNA en koncentration på 45 μg/ml.
Många biologiska studier ( DNA-mikroarray , kvantitativ PCR ) kräver kvalitativ och kvantitativ bestämning av små volymer nukleinsyror. Särskilda nanofotometrar [3] gör det möjligt att bestämma koncentrationen av prover utan hjälp av en kyvett i submikrolitervolymer, med start från 0,3 μl. Eftersom mätningar görs på ett outspätt prov är reproducerbarheten av resultaten mycket hög, och själva proverna kan användas efter analys.
Nukleinsyraprover innehåller ofta föroreningar av proteiner och andra organiska ämnen. Absorbansförhållandet vid 260 och 280 nm (A 260/280 ) används ofta för att utvärdera renheten hos ett preparat. Rent DNA har ett förhållande A 260/280 på cirka 1,8, ett RNA-prov utan föroreningar A 260/280 cirka 2.
Proteinföroreningar och förhållandet 260:280För att detektera proteinföroreningar i lösningar av nukleinsyror, analysera absorptionsförhållandet för lösningar vid våglängder på 260 och 280 nm, eftersom aromatiska aminosyror i proteiner absorberas vid 280 nm [1] [4] . Emellertid är inverkan av orenhetsproteiner på bestämningen av koncentrationen av nukleinsyror liten - endast vid en signifikant proteinkoncentration förändras förhållandet 260:280 signifikant [1] [5] .
Förhållandet 260:280 gör det möjligt att bestämma blandningen av nukleinsyror i proteinlösningar och blandningen av proteiner i lösningar av nukleinsyror:
| % ekorre | % nukleinsyra | förhållande 260:280 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 0,57 |
| 95 | 5 | 1,06 |
| 90 | tio | 1,32 |
| 70 | trettio | 1,73 |
Förhållandet 260:230 är mindre känsligt när man bestämmer proteinföroreningar i en nukleinsyralösning:
| % nukleinsyra | % ekorre | förhållande 260:230 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 2.00 |
| 95 | 5 | 1,99 |
| 90 | tio | 1,98 |
| 70 | trettio | 1,94 |
Sådana skillnader beror på det högre värdet av den molära extinktionskoefficienten för nukleinsyror vid våglängder på 260 och 280 nm i jämförelse med proteiner. Därför, även för en proteinlösning med en relativt hög koncentration, är bidraget till absorptionen vid våglängder på 260 och 280 nm litet. Proteinkontamination i nukleinsyralösning kan inte bestämmas med förhållandet 260:230.
Andra föroreningarFör diagnostiska ändamål är det ofta nödvändigt att bestämma mängden av ett visst DNA eller RNA. Mycket känsliga metoder har utvecklats för bestämning av DNA och RNA i mikrovolymer av prover - droppar som inte överstiger några få pikoliter. För detta används mikrofluidiska enheter för PCR med en enda kopia av nukleinsyran [7] [8] [9] [10] .