Sanger - metoden är en DNA- sekvenseringsmetod , även känd som kedjetermineringsmetoden . Denna sekvenseringsmetod föreslogs först av Frederick Sanger 1977 [1] , för vilken han tilldelades Nobelpriset i kemi 1980. Denna metod har varit den vanligaste i 40 år.
I den klassiska versionen av Sanger-metoden fungerar en av strängarna i det analyserade DNA:t som en mall för syntesen av en komplementär sträng av DNA- polymerasenzymet . Reaktionen med samma matris utförs i fyra olika rör som vart och ett innehåller:
Dideoxiribonukleotider (ddATP, ddGTP, ddCTP eller ddTTP) saknar en 3'-hydroxylgrupp, så ytterligare syntes avbryts efter deras inkludering i kedjan. I varje rör bildas alltså en uppsättning DNA-fragment av olika längd, som slutar i samma nukleotid (enligt den tillsatta dideoxinukleotiden). Efter slutförande av reaktionen separeras innehållet i rören genom polyakrylamidgelelektrofores under denaturerande betingelser, och gelerna autoradiograferas . Produkterna av fyra reaktioner bildar en "sekvenseringsstege", som låter dig "läsa" nukleotidsekvensen för ett DNA-fragment [2] [1] .
Sanger-metoden låter dig också bestämma nukleotidsekvensen för RNA , men den måste först "skrivas om" i form av DNA med omvänd transkription .
Hittills är DNA-sekvensering enligt Sanger helt automatiserad och utförs på speciella enheter, sekvenserare. Användningen av dideoxinukleotider med fluorescerande märkningar med olika emissionsvåglängder gör det möjligt att utföra reaktionen i ett provrör. Reaktionsblandningen separeras genom kapillärelektrofores i lösning, DNA-fragment som kommer ut från kapillärkolonnen registreras av en fluorescensdetektor . Resultaten analyseras med dator och presenteras som en sekvens av färgade toppar motsvarande fyra nukleotider. Sekvenerare av denna typ kan "läsa" vid en tidpunkt sekvenser av 500-1000 nukleotider långa. Som jämförelse tillåter pyrosekvenseringsmetoden , utvecklad 1996, ett steg för att bestämma sekvensen av ett mycket mindre antal nukleotider. Automatisering har kraftigt påskyndat sekvenseringsprocessen och möjliggjort sekvensering av hela genom , inklusive det mänskliga genomet [2] .