Kapillärelektrofores

Kapillärelektrofores , även känd som kapillär zonelektrofores ( CZE ), används för att separera joner genom laddning . I fallet med konventionell elektrofores rör sig laddade molekyler i en ledande vätska under påverkan av ett elektriskt fält . På 1960-talet föreslogs en kapillärelektroforesteknik för att separera molekyler efter laddning och storlek i en tunn kapillär fylld med en elektrolyt .

Utrustning

Kapillärelektrofores kräver relativt enkel utrustning. Schemat för experimentet visas i figur 1 . Huvudkomponenterna i systemet är applikationsflaskan, startflaskan, slutampullen, kapillären, elektroder, högströmsförsörjning, detektor och databehandlingsenhet. Provappliceringsflaskan, startflaskan och slutflaskan är fyllda med en elektrolyt, såsom en vattenhaltig buffertlösning. För att applicera provet doppas änden av kapillären i provflaskan och överförs sedan till startflaskan. Förflyttningen av de analyserade ämnena utförs under inverkan av ett elektriskt fält. Alla joner rör sig längs kapillären i en riktning under påverkan av elektroosmotisk ström. Analyterna separeras genom elektroforetisk rörlighet och detekteras nära slutet av kapillären. [ett]

Detektion

Detekteringen av separerade molekyler under kapillärelektrofores kan utföras av olika anordningar. De vanligaste enheterna upptäcker förändringar i absorptionen av strålning i det ultravioletta området eller i det synliga ljusområdet. I sådana system används typiskt en del av en kapillär som en cell. Banlängden för transmitterat ljus i kapillärelektrofores är i storleksordningen 50 mikrometer, vilket är mycket mindre än i fallet med konventionella ultravioletta celler, i vilka ljusvägens längd är i storleksordningen 1 centimeter.

Enligt Bouguer-Lambert-Beer-lagen är känsligheten hos en detektor proportionell mot längden på den väg som ljuset färdas genom cellen. För att öka känsligheten förlängs den väg som ljuset färdas längs, men när cellens storlek ökar minskar upplösningen. Kapillärröret kan expanderas vid detektionsplatsen, denna typ kallas en bubbelcell. I ett annat alternativ uppnås en ökning av vägen för transmitterat ljus genom att lägga till ytterligare en kapillär (se figur 2 ). Båda dessa metoder minskar separationseffektiviteten. [2]

Fluorescensdetektion kan användas vid kapillärelektrofores av naturligt fluorescerande prover eller kemiska modifieringar som introducerar fluorescerande etiketter. Denna detektionsmetod ger hög känslighet, men kan inte användas för att detektera icke-fluorescerande prover. Laserinducerad fluorescensdetektion används också, sådana kapillärelektroforessystem kan detektera i intervallet 10 -18 - 10 -21 mol.

För att särskilja liknande prover kan separationssystem för kapillärelektrofores kopplas direkt till masspektrometrar. I de flesta sådana system placeras änden av kapillären i en elektroaerosoljoniseringsapparat . De joniserade partiklarna analyseras vidare med masspektrometri. [2]

Separationsmetoder

Molekyler separeras genom kapillärelektrofores på grund av skillnader i rörlighet i ett pålagt elektriskt fält. Rörelsehastigheten ( ) för de separerade molekylerna i det applicerade fältet i förhållande till elektroden med motsatt laddning: $u_{p}$

$u_{p}=\mu _{p}E$

var är den elektroforetiska rörligheten och E är styrkan hos det elektriska fältet. Den elektroforetiska rörligheten är proportionell mot jonens laddning. I det fall då provet består av två typer av molekyler som skiljer sig i laddning sker separation som ett resultat av elektrofores. Den elektroforetiska rörligheten för ett ämne vid givna pH-värden är: $\mu _{p}$

$\mu _{p}={\frac {z}{6\pi \eta r}}$

var är den specifika laddningen för molekylen och är Stokes radie för molekylen: ${\displaystyle {z))$ $r$

$r={\frac {k_{B}T}{6\pi \eta \ D}}$

där är Boltzmann-konstanten och temperatur, och D är diffusionskoefficienten . Dessa ekvationer visar att en molekyls elektroforetiska rörlighet är proportionell mot laddningen och omvänt proportionell mot dess radie. Elektroforetisk rörlighet kan bestämmas experimentellt från tidpunkten för en molekyls rörelse i ett elektriskt fält med en given styrka: $k_B$ $T$

$\mu _{p}=\left({\frac {L}{t_{r}}}\right)\left({\frac {L_{t}}{V}}\right)$

var är avståndet från startpunkten till detektionsplatsen, är den tid det tar för den analyserade molekylen att nå detektionspunkten, är den elektriska fältstyrkan och är den totala längden av kapillären. [2] Eftersom det elektriska fältet endast verkar på laddade molekyler, separeras oladdade molekyler svagt genom kapillärelektrofores. $L$ $t_{r}$ $V$ ${\displaystyle L_{t))$

Rörelsehastigheten för de analyserade molekylerna under kapillärelektrofores beror på storleken på det elektroosmotiska flödet i bufferten. I allmänhet är det elektroosmotiska flödet riktat mot den negativt laddade katoden. Molekylerna skiljer sig i elektroforetiska rörligheter mot den motsatt laddade elektroden. [1] Negativt laddade partiklar rör sig mot den positivt laddade anoden, positivt laddade partiklar rör sig mot katoden i det elektroosmotiska flödets riktning (se figur 3 ).

Den elektroosmotiska flödeshastigheten kan representeras som: $u_{o}$

$u_{o}=\mu _{o}E$

var är den elektroosmotiska rörligheten lika med: $\mu _{o}$

$\mu _{o}={\frac {\epsilon \zeta }{\eta }}$

var är potentialen för kapillärväggen och är buffertlösningens relativa permittivitet. Elektroosmotisk rörlighet kan bestämmas genom att mäta fördröjningstiden för neutralt laddade molekyler. [2] Rörelsehastigheten ( ) för den analyserade molekylen i ett elektriskt fält kan representeras som: $\zeta$ $\epsilon$ $u$

$u_{p}+u_{o}=(\mu _{p}+\mu _{o})E$

På grund av att det elektroosmotiska flödet av buffertlösningen vanligtvis är större än det elektroforetiska flödet av de analyserade ämnena, rör sig alla analyserade molekyler med buffertlösningen till katoden. Negativt laddade molekyler stannar längre i kapillären på grund av motsägelser i deras elektroforetiska rörlighet. [1] Ordningen för rörelse av laddade molekyler visas i figur 3 : små katjoner rör sig snabbt, små multipelladdade anjoner är kraftigt fördröjda. [2]

Effektivitet och upplösning

Antalet teoretiska plattor, eller separationseffektivitet i fallet med kapillärelektrofores, ges av ekvationen:

${\displaystyle N={\frac {\mu V}{2D_{m))))$

där är antalet teoretiska plattor, är den skenbara rörligheten i separationsmediet och är diffusionskoefficienten för ämnet som ska separeras. Enligt denna ekvation begränsas separationseffektiviteten endast av diffusion och är proportionell mot det elektriska fältets styrka. Separationseffektiviteten genom kapillärelektrofores är i allmänhet mycket högre än den för andra separationsmetoder såsom högpresterande vätskekromatografi . I motsats till HPLC sker i fallet med kapillärelektrofores ingen massöverföring mellan faserna. [2] Flödesprofilen i fallet med elektroosmotiska flödessystem är platt, i motsats till den laminära profilen för kromatografiska kolonner där separation sker under tryck (se figur 5 ). Som ett resultat, under elektroosmotisk separation, sker inte bandexpansion, som vid kromatografi. Separation genom kapillärelektrofores kan ha flera hundra tusen teoretiska plattor. [3] $N$ $\mu$ ${\displaystyle D_{m))$

Upplösningen ( ) för separation av kapillärelektrofores kan skrivas som: $R_{s}$

$R_{s}={\frac {1}{4))\left({\frac {\triangle \mu _{p}{\sqrt {N))}{\mu _{p}+\ mu _{o}}}\right)$

I enlighet med denna ekvation uppnås den maximala upplösningen vid liknande värden för elektroforetiska och elektroosmotiska rörligheter, men med motsatt tecken. Dessutom kräver hög upplösning låg hastighet och kräver följaktligen längre separationstid. [2]

Relaterade metoder

Separation genom kapillärelektrofores är baserad på skillnader i den elektroforetiska rörligheten hos molekylerna som ska separeras. Vissa klasser av molekyler kan dock inte separeras eftersom de är oladdade eller skiljer sig något i elektroforetisk rörlighet. För att separera neutrala (oladdade) provkomponenter används micellär elektrokinetisk kromatografi (MEKC) , där ytaktiva ämnen tillsätts till buffertlösningen för att bilda miceller . Laddade polymerer, såsom DNA, kan separeras i gelfyllda kapillärer; gelen bromsar längre molekyler mer än kortare. Denna variant av kapillärelektrofores kallas kapillärgelelektrofores. Vissa kapillärelektroforessystem kan användas för kromatografi i mikroskala. Även kapillärelektroforessystem kan användas för isotakofores , isoelektrisk fokusering och affinitetselektrofores .

Anteckningar

↑ 1 2 3 4 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S.R. "Principles of Instrumental Analysis" 6:e uppl. Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ 1 2 3 4 5 6 7 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S.R. "Principles of Instrumental Analysis" 6:e uppl. Kapitel 30 Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ Skoog, D.A.; Holler, FJ; Nieman, TA "Principles of Instrumental Analysis, 5th ed." Saunders college Publishing: Philadelphia, 1998 .

Litteratur

Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem . 1984 , 56 , 111.
Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem . 1984 , 56 , 113.
Foley, JP Anal. Chem . 1990 , 62 , 1302.
Carretero, AS; Cruces-Blanco, C.; Ramirez, S.C.; Pancorbo, AC; Gutierrez, A.F.J. Agric. mat. Chem . 2004 , 52 , 5791.
Cavazza, A.; Corradini, C.; Laura, A.; Nicoletti, I. J. Agric. matkem . 2000 , 48 , 3324.
Rodrigues, MRA; Caramao, EB; Arce, L.; Rios, A.; Valcarcel, M. J. Agric. matkem . 2002 , 50 , 4215.

Se även

elektrofores