Elektroporering

Den aktuella versionen av sidan har ännu inte granskats av erfarna bidragsgivare och kan skilja sig väsentligt från versionen som granskades den 27 januari 2022; kontroller kräver 2 redigeringar .

Elektroporation  är skapandet av porer i ett dubbelskikts lipidmembran under påverkan av ett elektriskt fält. Detta fenomen används inom bioteknik för att introducera makromolekyler (vanligtvis DNA eller RNA ) i däggdjurs- , bakterie- eller växtceller och används också inom medicin och industri.

Förstärkning av det elektriska fältet under elektroporation

Fenomenet elektroporation bygger på det faktum att membran har förmågan att koncentrera ett elektriskt fält. Låt en potentialskillnad U appliceras mellan två platta parallella elektroder belägna på avstånd L, och gapet mellan dem fylls med en svagt ledande elektrolyt. Då är fältstyrkan jämnt fördelad över hela utrymmet mellan dem. Låt oss nu placera ett dubbelskiktigt lipidmembran i mitten av cellen, som har så hög resistans att det kan betraktas som ett icke-ledande dielektrikum. Då kommer hela potentialskillnaden U att koncentreras på membranet.

Den elektriska fältförstärkningen kommer uppenbarligen att vara lika med L/h ~ 10^6 om vi väljer L ~ 1 cm, h ~ 5 nm. Sålunda, i överensstämmelse med de experimentella resultaten, är det tillräckligt att applicera en potentialskillnad i storleksordningen hundratals millivolt på elektroderna för att inducera elektroporering av dubbelskiktet. Om celler med en diameter på cirka 10 mikron nu finns mellan elektroderna, och vi vill få dem att elektroporeras, kommer mycket högre spänningar att behöva läggas på. På grund av membranets höga motstånd kommer lösningen i cellen att vara ekvipotential, det vill säga det yttre fältet kommer att avskärmas av mobila joner, som bildar diffusa plattor av dubbla elektriska lager. Således kommer spänningshoppet på cellen att vara 2UR/L, vilket kommer att koncentreras på membranet i området för cellens två poler. Om vi ​​accepterar att det är nödvändigt att ha, säg, 0,5 V, så kommer det att vara nödvändigt att applicera U ~ L / R * 0,5 V på elektroderna. Således, med L ~ 1 cm, R ~ 5∙10^-4 cm får vi U ~ (1∙0,5)/(5∙10^(-4)) ~ 1 kV. Därför är det i experiment med cellsuspensioner och liposomer nödvändigt att använda speciella elektroporatorer som kan generera korta pulser med en amplitud på upp till 1–10 kV.

När elektriska fältpulser med en styrka från flera hundra till flera tusen volt per cm och en varaktighet från tiotals mikrosekunder till tiotals millisekunder appliceras på en cellsuspension, är det möjligt att orsaka en kraftig ökning av ledningsförmågan hos cellmembran. Efter måttlig elektrisk behandling minskar cellledningsförmågan till normala värden inom några sekunder till flera minuter. Mer intensiv elektrisk behandling leder till irreversibel förstörelse av vissa celler.

I experiment med celler är det svårt att kontrollera spänningen direkt på cellmembranet. Dessutom är cellmembranet ett extremt komplext system. Membranets huvudsakliga barriärfunktioner utförs av ett fosfolipiddubbelskikt, som genomsyras av proteiner som fungerar som selektiva kanaler eller aktiva pumpar för joner och metaboliter. Möjliga orsaker till ökningen av elektrisk ledningsförmåga kan vara förändringar i både lipiddubbelskiktet och proteiner. Experiment med ett artificiellt dubbelskiktslipidmembran (BLM) visade möjligheten av dess elektriska nedbrytning vid spänningar nära de vid vilka nedbrytning observeras i cellmembranet. Det har visat sig att den elektriska nedbrytningen av BLM av en viss sammansättning kan vara reversibel. Detta indikerar att det är nedbrytningen av lipidkomponenten som är ansvarig för ökningen av cellpermeabiliteten. Experiment med BLM visade att elektriskt genombrott sker stokastiskt och den genomsnittliga membranlivslängden beror olinjärt på spänningen. Dessa observationer ledde till utvecklingen av en teori om bildning och utveckling av porer i flytande lipiddubbelskikt i ett elektriskt fält. I slutet av 1990-talet, med hjälp av högprecisionsmätningar av membrankonduktivitet, var det möjligt att registrera förekomsten av enstaka elektroporer i BLM. Deras medeldiameter är cirka 0,5 nm. I cellmembran upptäcktes de med hjälp av elektronmikroskopi.

Teorin om membranelektroporation

Teorin om BLM-elektroporation antyder att en lokal omarrangering av strukturen sker i lipidmembranet med två skikt, vilket leder till uppkomsten av en genomgående vattenkanal. Två grundläggande porkonfigurationer är möjliga, hydrofila och hydrofoba. I en hydrofob por är porväggarna fodrade med lipidsvansar, medan de i en hydrofil por är fodrade med fosfolipidhuvuden. Vid små radier är en hydrofob por energetiskt gynnsam och vid stora radier en hydrofil por. Vatten har en högre dielektricitetskonstant än lipider. Därför har ett membran som innehåller porer mindre energi i ett externt elektriskt fält. Denna energivinst är proportionell mot arean av poren och kvadratisk i dess radie. Vid en porradie r* blir energierna för de hydrofoba och hydrofila porerna lika. Det finns ett lokalt minimum på energikurvan som motsvarar det metastabila ledande tillståndet för dubbelskiktet, från vilket det, med en viss frekvens, övergår till det initiala ostörda tillståndet med en låg konduktivitet i systemet, eller genomgår ett avbrott. Hastigheten för bildning av hydrofila porer i ett lipiddubbelskikt med enhetsarea (Kc) kan beskrivas med ekvationen

var

,

Här är a arean per en lipidmolekyl, d är dubbelskiktets tjocklek,  är vakuumdielektricitetskonstanten,  är den dielektriska permittiviteten för dubbelskiktet,  är permittiviteten för vatten, k är Boltzmann-konstanten,  är frekvensen av laterala fluktuationer av lipidmolekyler,  är porradien som motsvarar övergångstillståndet, T är temperaturen, U är den elektriska spänningen över dubbelskiktet,  är aktiveringsenergin för poren i frånvaro av ett elektriskt fält.

Det antas att poröverväxthastigheten inte beror på det applicerade elektriska fältet och pordensiteten på dubbelskiktet.

Leverans av makromolekyler till celler genom elektroporering

Experimenten som beskrivs ovan reducerades faktiskt till att mäta den elektriska ström som små joner bär genom porerna. Tillsammans med detta fann man att elektrisk behandling främjar överföringen genom membran av makromolekyler, vars storlek överstiger diametern på elektroporerna. Dessutom har en korrelation noterats mellan elektroporering och transport av stora molekyler. I vetenskapliga arbeten, på exemplet med transport av DNA-molekyler, bevisades det att de kan expandera porerna, som sedan långsamt (~ 100 sek.) slappnar av till sitt ursprungliga tillstånd. Dessutom visade direkta experiment där också att DNA-elektrofores spelar en viktig roll inte bara vid överföringsstadiet av dessa molekyler till cellen, utan även när de passerar genom membranet. Det elektriska fältet pressar bokstavligen plasmid-DNA in i en liten por, samtidigt som den expanderar. Vi kan säga att plasmid-DNA-molekylerna själva spelar rollen som gyllene mikroskopiska kulor som används i "gene gun"-metoden. Endast de drivande krafterna är av annan karaktär - elektriska i det första fallet, mekaniska i det andra. En annan viktig innovation implementerad i vetenskapliga arbeten är användningen av en 2-puls elektrisk bearbetningsteknik, som gjorde det möjligt att separera två fältfunktioner i tid - elektroporering och elektroforetisk. Den första impulsen var kraftfull men kort; sedan följde ett intervall med variabel varaktighet, och slutligen slogs ett svagt konstant fält på. Införandet av DNA före den första pulsen resulterade i hög transfektion och överföring av stora dextranmolekyler, medan införandet av DNA under interpulsintervallet praktiskt taget inte hade någon effekt.

Under det senaste decenniet har elektroporering använts för transdermal överföring av läkemedel till människokroppen. Elektroporation är grunden för flera transdermala överföringstekniker som kallas akvafores , icke-invasiv mesoterapi, nålfri mesoterapi eller injektionsfri mesoterapi.

Medicinska applikationer

Metoden för elektroporering används vid behandling av onkologiska sjukdomar: irreversibel elektroporering av en tumör leder till lokal förstörelse av dess celler, mikrosekunders elektriska impulser på 2000-3000 volt i membranen av tumörceller bildar mikroporer, vilket leder till störning av cellulär homeostas och celldöd [1] .

Industriella applikationer

Industriella anläggningar för elektroporering av produkter (tekniken kallas PEF - pulselektriskt fält) används som ett av stegen i produktionsprocessen: vid beredning av juicer och smoothies som en mer skonsam desinfektionsmetod än pastörisering eller ultrapastörisering , och vid produktion av frysta och torkade produkter - för bättre bevarande av produkters organoleptiska egenskaper, minskning av vattenförbrukning och produktionsförluster. Världens ledande företag inom implementering av teknologi inom livsmedelsproduktion är Elea GmbH från Tyskland [2] .

Anteckningar

  1. ↑ Frälsning för en patient med inoperabelt adenokarcinom i bukspottkörteln var metoden för irreversibel elektroporering . www.ronc.ru _ National Research Center of Oncology uppkallat efter N.N. N. N. Blokhin (21 januari 2022). Hämtad: 27 januari 2022.
  2. ↑ Elea GmbH  . www.potatopro.com . Hämtad: 18 januari 2022.

Länkar