Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) är en molekylärbiologisk metod som låter dig bestämma interaktionerna (spatial närhet) av kromatinregioner som ligger på ett avsevärt avstånd från varandra i genomet . [1] Sådana interaktioner är av intresse för att fastställa regleringselement . Regulatoriska element i celler kan lokaliseras på ett avsevärt avstånd från promotorn för den reglerade genen (till exempel cis-regulatoriska element , trans-regulatoriska element , isolatorer , förstärkare). För att förstå mekanismerna för sådana interaktioner är det nödvändigt att känna till det rumsliga arrangemanget av kromatinregioner i förhållande till varandra, vilket denna metod gör det möjligt att bestämma de novo . I sin tur är informationen som erhålls viktig för att förstå mekanismerna för reglering av genuttryck . [2]
ChIA-PET är baserat på användningen av ChIP , 3C ( Chromosome Conformation Deermination ) och Paired -end-tag- sekvensering , för vilken högkapacitetssekvensering och ytterligare datorbearbetning av resultaten används. [3]
Metoden användes först 2009 [1] för att bestämma avlägsna ER-alfa- bindningsställen i human bröstcancer. Därefter användes den till exempel för att konstruera en interaktom (karta över möjliga interaktioner) medierad av CTCF i embryonala stamceller från mus [4] .
ChIA-PET kombinerar kapaciteten hos både ChIP- och 3C [5] -baserade metoder , vilket förbättrar kapaciteten hos var och en. Den traditionella ChIP-metoden låter dig bestämma interaktionen mellan ett visst protein och DNA och kan användas för att söka efter transkriptionsfaktorbindningsställen . Med hjälp av ChIP-seq kan de novo bindningsställen för proteinet av intresse bestämmas i hela genomet. Om ett protein binder regioner av kromatin som är långt ifrån varandra på kromosomen men nära i rymden, kan ChIP-seq identifiera var och en av dem, men indikerar inte deras interaktion. Men inte alla sekvenser som bestäms av ChIP-seq-metoden är unikt kartlagda i genomet och alla är inte funktionella bindningsställen [6] .
3C- och ChIA-PET-metoderna är baserade på teorin om proximal ligering ( proximity ligation ), som säger att ändarna av kromatinregionerna associerade med proteinkomplexet, som är i närheten, kommer att ligeras till varandra med större sannolikhet än ändarna av regionerna i lösning eller associerade med ett annat proteinkomplex.
3C-metoden tillåter en att bestämma den rumsliga strukturen av kromatin, men tillåter inte en att bestämma det interagerande proteinet [5] . Ett betydande problem är behovet av noggrann kunskap om sekvensen av interagerande loci . Detta är nödvändigt för valet av primrar för den kvantitativa eller semikvantitativa PCR-analys som används för att bestämma dem. (Det bör noteras att det kan finnas flera loci - kandidater för interaktioner - bestämt av 3C-metoden). ChIA-PET-metoden tillåter de novo bestämning av den rumsliga strukturen hos kromatin som är associerad med ett specifikt protein. Det vill säga, å ena sidan kräver det inte kunskap om DNA-sekvensen i området för interaktion, och å andra sidan beror det helt på specificiteten hos de antikroppar som används .
| Chip | Chip seq | ChIA-PET | 3C | |
|---|---|---|---|---|
| Behöver specifika antikroppar | + | + | + | - |
| Det är nödvändigt att känna till DNA-sekvensen vid det studerade stället | + | - | - | + |
| Referensgenom krävs | - | + | + | - |
| Metoden ger information om | Bindande webbplatser | Om de novo bindningsställen |
Om de novo bindningsställen + kromatinkonformation |
Kromatinkonformationer |
DNA-proteinkomplex är tvärbundna ospecifikt med formaldehyd. Provet utsätts för ultraljud , medan DNA-molekyler krossas till fragment och löst bundna ospecifika komplex förstörs. Som ett resultat erhålls DNA-fragment i starka komplex med proteiner. Vidare, med hjälp av specifika antikroppar fixerade på magnetiska pärlor, utfälls kromatinfragment associerade med proteinet av intresse. Ofta är studieobjekten kända transkriptionsfaktorer [1] . Utfällda komplex avlägsnas från lösningen med magnetiska pärlor med användning av en magnet. De isolerade komplexen delas upp i 2 alikvoter och oligonukleotid-semi -linkers med en känd sekvens "sys" till ändarna av DNA-molekylerna . Halvlinker A finns i den ena alikvoten och halvlinker B finns i den andra. Båda halvlänkarna innehåller det ställe som känns igen av Mmel- restriktionsenzymet och skiljer sig från varandra genom en "streckkod" av två nukleotider : CG för halv- linker A och AT för halvlänkare B. Som ett resultat kan länkarna senare, under sekvensering, särskiljas från varandra med "streckkoden". I nästa steg kombineras två alikvoter och proximal ligering sker, varvid halvlänkarna ligeras ovanpå varandra för att bilda fullängdslinkers. Länkare med AA (CG/CG) eller BB (AT/AT) "streckkoder" anses vara troliga ligeringsprodukter inom samma komplex, medan länkar med AB (CG/AT) "streckkoder" anses vara chimära ligeringsprodukter av DNA associerade med olika proteinkomplex Förberedelse för sekvensering involverar bearbetning av komplexen med Mmel restriktionsenzym [8] , som klyver DNA på ett visst avstånd från dess igenkänningsställe i halvlänkaren. Som ett resultat, i slutet av detta steg, erhålls konstruktioner innehållande ett par "taggar" ( eng. tag ) (20 bp vardera) på båda sidor av den fullständiga länken (38 bp). De resulterande fragmenten sekvenseras i båda ändarna ( PET ) . Taggarna kartläggs sedan på genomet. [7] [9]
Datorbehandling av sekvenseringsresultat inkluderar 6 moduler [7] [10]
Alla lässekvenser är uppdelade i sekvenser med läsbara "streckkoder" och oläsbara "streckkoder". Om "streckkoden" inte kan läsas, "kasseras" sekvensen från bearbetning. Om "streckkoden" kan läsas, är sekvenserna anpassade till länkarna. Alla erhållna sekvenser är uppdelade i chimära (bildade genom ligering av DNA från olika komplex och innehållande A/B-linkern) och icke-chimära (innehållande A/A- eller B/B-linkern). Det bör noteras att bland de sekvenser som innehåller A/A eller B/B kan chimära sådana också förekomma. Vidare "kasseras" sekvenserna för länkarna själva och sekvenserna av "taggar" (PET) analyseras. [7] [10]
Kartläggning av PETsSekvenserna som erhölls i föregående steg mappas till referensgenomet. I det första steget isoleras 100 % inriktade sekvenser , som kan kartläggas på ett lokus (unikt) eller på många loci. Av de återstående sekvenserna är de som innehåller 1 substitution i sekvensen ( engelska missmatch ) med referensgenomet isolerade, de är också uppdelade i unika och sekvenser med multipel mappning. Alla andra sekvenser är icke-mappade. Alla sekvenser utom de unikt mappade "kasseras" från bearbetning. [7] [10]
Klassificering av PETsDet finns två grupper av PET:er: "self-ligated" ( engelsk self-ligation PETs ) och "interligated" ( engelsk interligation PETs ). "Självligerade" ( engelsk self-ligation PETs ) motsvarar ändarna av ett ChIP-DNA-fragment, de bör vara belägna på samma kromosom på kort avstånd från varandra, i orienteringen "huvud till svans". "Interligerade" ( eng. inter-ligation PETs ) delas in i intrakromosomala (karterade på samma kromosom på stort avstånd), interkromosomala (karterade på olika kromosomer) och ligerade i olika orienteringstaggar ( eng. different orientation ligation PETs ) (mappade) på samma kromosom på kort avstånd, men i fel orientering eller på olika DNA-strängar). Gränsen som separerar "självligerade" PET från "interligerade" PET bestäms naturligt av längden på DNA-fragmenten som erhålls vid en given "ljud" intensitet. I olika experiment var det 3-4,6 Kb. [7] [10]
Bestämning av proteinbindningsställenSjälvligeringstaggar ( self-ligation PETs ) används för att bestämma proteinbindningsställen . Proceduren liknar den som används i ChIP-seq .
Definition av kromatininteraktionerI förutsägelsen av denna typ av interaktion används " inter -ligation" PETs .
Visualisering och organisering av resultatData från de tidigare stegen läggs in i databaser för lagring, bearbetning och eventuell visualisering.
Följande datorprogram används i ChIA-PET-experiment