Virala vektorer är verktyg som ofta används av molekylärbiologer för att leverera genetiskt material till celler . Denna process kan utföras inuti en levande organism ( in vivo ) eller i cellkultur ( in vitro ). Virus har specialiserade molekylära mekanismer för att effektivt transportera sina genom inom de celler de infekterar. Leveransen av gener eller annat genetiskt material av en vektor kallas transduktion , och infekterade celler beskrivs som transducerade. Molekylärbiologer använde denna mekanism först på 1970-talet. Paul Berg använde en modifierad SV40 innehållande bakteriofag λ DNA för att infektera odlade njurceller från apan [1] .
Förutom att de används i molekylärbiologisk forskning, används virala vektorer för genterapi och vaccinutveckling .
Virala vektorer är skräddarsydda för deras specifika tillämpning, men delar vanligtvis några nyckelegenskaper.
Virala vektorer utvecklades ursprungligen som ett alternativ till infödd DNA- transfektion för molekylärgenetiska experiment . Jämfört med traditionella metoder som kalciumfosfatfällning kan transduktion säkerställa att nästan 100 % av cellerna är infekterade utan att allvarligt påverka cellviabiliteten. Dessutom integreras vissa virus i cellgenomet , vilket främjar stabilt uttryck.
Proteiner som kodas av gener kan uttryckas med hjälp av virala vektorer, vanligtvis för att studera funktionen hos ett visst protein. Virala vektorer, särskilt retrovirus, som stabilt uttrycker markörgener såsom GFP används i stor utsträckning för att permanent märka celler för att spåra dem och deras avkomma, såsom i xenotransplantationsexperiment , där celler infekterade in vitro implanteras i ett värddjur.
Geninsättning är billigare än genknockout . Men detta ger mindre tillförlitliga resultat, eftersom det ibland är ospecifikt och har effekter utanför målet på andra gener. Värddjursvektorer spelar också en viktig roll.
Genterapi är en metod för att korrigera defekta gener som är ansvariga för utvecklingen av en sjukdom. I framtiden kan genterapi vara ett sätt att behandla genetiska störningar , såsom svår kombinerad immunbrist , cystisk fibros eller till och med hemofili A. Eftersom dessa sjukdomar beror på mutationer i DNA-sekvensen för vissa gener har genterapistudier använt virus för att leverera vildtypskopior av dessa gener till celler i patientens kropp. Det har varit en stor mängd labbframgångar med genterapi. Men flera problem med viral genterapi måste övervinnas innan den används i stor utsträckning. Immunsvaret mot virus förhindrar inte bara leveransen av gener till målceller, utan kan orsaka allvarliga komplikationer för patienten. I en av de tidiga genterapiförsöken 1999 resulterade detta i att Jesse Gelsinger dog , som behandlades med en adenoviral vektor. [2]
Vissa virala vektorer, såsom gammaretrovirus, sätter in sina genom på en till synes slumpmässig plats på en av värdens kromosomer , vilket kan störa cellulär genfunktion och leda till cancer. År 2002, i en studie med allvarlig kombinerad immunbrist retroviral genterapi , utvecklade fyra patienter leukemi som ett resultat av behandlingen; [3] tre patienter återhämtade sig efter kemoterapi. [4] Vektorer baserade på adenoassocierade virus är mycket säkrare i detta avseende, eftersom de alltid integreras på samma plats i det mänskliga genomet och används vid olika sjukdomar som Alzheimers sjukdom [5] .
Virus som uttrycker patogena proteiner utvecklas för närvarande som vacciner mot dessa patogener baserat på samma logik som DNA-vacciner . T-lymfocyter känner igen celler infekterade med intracellulära parasiter baserat på främmande proteiner som produceras i cellen. T -cellsimmunitet är avgörande för skydd mot virusinfektioner och sjukdomar som malaria . Det virala vaccinet inducerar uttryck av patogena proteiner i värdceller på ett sätt som liknar Sabins poliovaccin och andra försvagade vacciner. Men eftersom virusvacciner endast innehåller en liten del av patogenens gener är de mycket säkrare och sporadisk infektion av patogenen är inte möjlig.
Under 2000-talet utvecklas vacciner baserade på adenovirusvektorer aktivt [6] .
Retrovirus är en av grunderna för moderna genterapimetoder. Rekombinanta retrovirus, såsom Moloneys murina leukemivirus, kan stabilt integreras i värdgenomet. De innehåller omvänt transkriptas för att skapa en DNA-kopia av RNA-genomet och integras, vilket möjliggör integration i värdgenomet . De har använts i ett antal FDA-godkända kliniska prövningar som SCID-X1-studien [7] .
Retrovirala vektorer kan antingen vara replikationskompetenta eller replikationsdefekta. Replikationsbristande vektorer är det vanligaste valet i forskning eftersom virus har de kodande regionerna för gener som behövs för extra omgångar av replikation och virionpaketering ersatta av andra gener eller raderade. Dessa virus kan infektera målceller och leverera den virala nyttolasten, men kan sedan inte fortsätta den typiska lytiska vägen som leder till cellys och död.
Omvänt innehåller replikationskompetenta virala vektorer alla nödvändiga gener för virionsyntes och fortsätter att föröka sig så snart infektion inträffar. Eftersom det virala genomet för dessa vektorer är mycket längre, är längden av den faktiska infogade genen av intresse begränsad jämfört med den möjliga längden av insättningen för replikationsdefekta vektorer. Beroende på den virala vektorn är den typiska maximala längden för en giltig DNA-insättning i en replikationsdefekt viral vektor vanligtvis runt 8-10 kB. [8] Även om detta begränsar introduktionen av många genomiska sekvenser, kan de flesta cDNA-sekvenser fortfarande rymmas.
Den största nackdelen med att använda retrovirus som Moloney retrovirus är behovet av aktiv celldelning för transduktion . Som ett resultat är celler såsom neuroner mycket resistenta mot infektion och transduktion av retrovirus.
Det finns en oro för att insertionsmutagenes på grund av integration i värdgenomet kan leda till cancer eller leukemi . Detta problem förblev teoretiskt tills genterapi för tio patienter med SCID-X1 med Maloney-musleukemiviruset [9] resulterade i två fall av leukemi orsakad av aktivering av LMO2- onkogenen på grund av nära integration av vektorn. [tio]
Lentivirus är en underklass av retrovirus. De används ibland som genterapivektorer på grund av deras förmåga att integreras i genomet hos icke-delande celler, vilket är unikt för lentivirus eftersom andra retrovirus endast kan infektera delande celler. Det virala genomet, i form av RNA , genomgår omvänd transkription när viruset kommer in i cellen för att producera DNA , som sedan infogas i genomet på en slumpmässig position (nya fynd tyder faktiskt på att införandet av viralt DNA inte är slumpmässigt, men är riktad mot specifika aktiva gener och associerad med genomorganisation [11] ) av ett viralt integrasenzym . Vektorn, som nu kallas ett provirus , finns kvar i genomet och förs vidare till cellens avkomma när den delar sig. Integrationsplatsen är oförutsägbar, vilket kan skapa problem. Proviruset kan störa funktionen hos cellulära gener och leda till aktivering av cancerfrämjande onkogener , vilket ger upphov till oro för eventuell användning av lentivirus i genterapi. Studier har dock visat att lentivirala vektorer har mindre tendens att integreras på platser som kan orsaka cancer än gamma-retrovirala vektorer. [12] Mer specifikt visade en studie att lentivirala vektorer inte orsakade vare sig en ökning av förekomsten av tumörer eller en tidigare uppkomst av tumörer hos möss med en signifikant högre förekomst av tumörer. [13] Dessutom observerades ingen ökning av mutagena eller onkologiska händelser i kliniska studier med lentivirala vektorer för att leverera genterapi för behandling av HIV.
Av säkerhetsskäl bär lentivirala vektorer aldrig de gener som är nödvändiga för deras replikation. För att erhålla lentivirus transfekteras flera plasmider till en så kallad packaging-cellinje, vanligtvis HEK 293 . En eller flera plasmider, vanligtvis kallade förpackningsplasmider, kodar för virionproteiner , såsom kapsiden och omvänt transkriptas . Den andra plasmiden innehåller det genetiska materialet som kommer att levereras av vektorn. Det transkriberas för att producera det virala enkelsträngade RNA-genomet och markeras av närvaron av ψ (psi)-sekvensen. Denna sekvens används för att packa genomet till ett virion.
Till skillnad från lentivirus, integreras inte adenoviralt DNA i genomet och replikerar inte under celldelning. Detta begränsar deras användning i grundforskning, även om adenovirala vektorer fortfarande används i in vitro- experiment såväl som in vivo . [14] Deras huvudsakliga användning är i genterapi och vaccination [15] [16] . Så här används humant adenovirus för vaccinet Sputnik V. Eftersom människor ofta kommer i kontakt med adenovirus som orsakar luftvägs-, gastrointestinala och ögoninfektioner, har de flesta patienter redan utvecklat neutraliserande antikroppar som kan inaktivera viruset innan det når målcellen. För att övervinna detta problem undersöker forskare för närvarande adenovirus som infekterar olika arter som människor inte har någon immunitet mot.
Adeno-associerat virus (AAV) är ett litet virus som infekterar människor och vissa andra primatarter. Det är för närvarande känt att AAV inte orsakar sjukdom och framkallar ett mycket svagt immunsvar. AAV kan infektera både delande och icke-delande celler och kan införliva sitt genom i värdcellens genom. Dessutom förblir AAV mestadels episomalt (replikation utan inkludering i kromosomen); uppfylla ett långt och stabilt uttryck. [17] Dessa egenskaper gör AAV till en mycket attraktiv kandidat för utveckling av virala vektorer för genterapi. [1] AAV kan dock bara ta in upp till 5 KB, vilket är betydligt mindre än AAV:s ursprungliga kapacitet. [17]
Dessutom, på grund av dess potentiella användning som en genterapivektor, har forskare skapat en förändrad AAV som kallas självsupplementerande adenoassocierat virus (scAAV). Medan AAV paketerar en DNA-sträng och kräver en andra strängsyntesprocess, paketerar scAAV båda strängarna, som hybridiseras tillsammans för att bilda dubbelsträngat DNA. Genom att hoppa över syntes av andra strängar möjliggör scAAV snabbt uttryck i cellen. [18] Annars delar scAAV många av egenskaperna hos sin AAV-motsvarighet.
Hybridvektorer är vektorvirus som är genetiskt modifierade för att ha egenskaperna hos mer än en vektor. Virusen modifieras för att undvika bristerna hos typiska virala vektorer, som kan ha begränsad laddningskapacitet, immunogenicitet, genotoxicitet och kanske inte stöder långsiktigt adekvat transgenexpression . Genom att ersätta oönskade element med önskvärda förmågor kan hybridvektorer i framtiden överträffa standardtransfektionsvektorer vad gäller säkerhet och terapeutisk effekt. [19]
Valet av en viral vektor för att leverera genetiskt material till celler är förknippat med vissa logistiska problem. Det finns ett begränsat antal virala vektorer tillgängliga för terapeutisk användning. Vilken som helst av dessa få virala vektorer kan framkalla ett immunsvar från värden om vektorn ses som en främmande inkräktare. [20] [21] När den väl har använts kan den virala vektorn inte användas effektivt igen hos en patient eftersom den kommer att kännas igen av kroppen. Om ett vaccin eller genterapi misslyckas med kliniska prövningar kan viruset inte användas igen hos en patient för ett annat vaccin eller genterapi i framtiden. Redan existerande immunitet mot den virala vektorn kan också finnas hos patienten, vilket gör behandlingen ineffektiv för den patienten. [20] [22] Det är möjligt att motverka redan existerande immunitet när man använder en viral vektor för vaccination genom att prima med ett icke -viralt DNA-vaccin , men denna metod utgör ett annat problem och hinder i vaccindistributionsprocessen. [23] Befintlig immunitet kan också utmanas genom att öka dosen av vaccinet eller ändra vaccinationsvägen . [24] Vissa nackdelar med virala vektorer (såsom genotoxicitet och lågt transgenuttryck) kan övervinnas med hybridvektorer.