Dendrotoxiner är en klass av presynaptiska neurotoxiner som produceras av mamba- ormar (och som finns i deras gift ) och blockerar vissa subtyper av spänningsstyrda kaliumkanaler i neuroner , vilket ökar frisättningen av acetylkolin vid neuromuskulära synapser . På grund av sin höga potens och selektivitet för kaliumkanaler har dendrotoxiner visat sig vara extremt användbara som farmakologiska medel för att studera strukturen och funktionen hos dessa jonkanalproteiner .
Dendrotoxiner blockerar vissa undertyper av spänningsstyrda kaliumkanaler (K + ) i neuroner. I nervsystemet är spänningsstyrda K + -kanaler ansvariga för membranrepolarisering och styr varaktigheten av aktionspotentialer . Dendrotoxin har visat sig binda till kaliumkanalerna i Ranviers intercepts av motorneuroner [1] och blockera aktiviteten av kaliumkanaler. Således ökar dendrotoxiner varaktigheten av aktionspotentialen och ökar frisättningen av acetylkolin vid den neuromuskulära förbindelsen, vilket kan leda till muskelöverexcitation och kramper.
Dendrotoxiner är ~7kDa proteiner, bestående av en enda peptidkedja på cirka 57-60 aminosyror. Flera homologer av a-dendrotoxin har isolerats, alla med en något annorlunda sekvens. Den molekylära arkitekturen och konformationen hos dessa proteiner är dock mycket lika. Dendrotoxiner har en mycket kort 3 10 helix nära peptidens N-terminal, medan två varv av α-helixen förekommer nära C-terminalen. Ett dubbelsträngat antiparallellt β-ark upptar den centrala delen av molekylstrukturen. Dessa två β-strängar är förbundna med en förvrängd β-svängregion [2] , som förmodligen spelar en viktig roll i proteinbindningsaktivitet. Alla dendrotoxiner är tvärbundna av tre disulfidbindningar , som tillför stabilitet till proteinet och till stor del bestämmer dess konformation. Cysteinradikalerna som bildar dessa disulfidbindningar är identiska till sin plats i alla medlemmar av dendrotoxinfamiljen, de är belägna i C7-C57, C16-C40 och C32-C53-regionerna (numrerade enligt α-dendrotoxiner).
Dendrotoxiner är strukturellt homologa med serinproteashämmare (SPI), inklusive aprotinin . Det visades att sekvenserna för a-dendrotoxin och ISP är 35 % identiska och har identiska disulfidbindningar. Trots den strukturella homologin mellan dessa två proteiner har dendrotoxiner inte någon mätbar hämmande effekt på koagulationsfaktorn, till skillnad från ICP. Denna förlust av aktivitet är möjligen resultatet av frånvaron av nyckelaminosyraradikaler som producerar strukturella skillnader som förhindrar nyckelinteraktioner som krävs för ICP-aktivitet.
Dendrotoxiner är basiska proteiner som har en positiv laddning vid neutralt pH . De flesta av de positivt laddade aminosyraradikalerna finns i botten av strukturen, vilket skapar en katjonisk region i en del av proteinet. Den positiva laddningen kommer från lysin (Lys) och arginin (Arg) radikalerna, som är koncentrerade på tre huvudställen: nära aminoterminalen (Arg3, Arg4, Lys5), nära C-terminalen (Arg54, Arg55) och en smalt område av β-svängen ( Lys28, Lys29, Lys30) [3] . Man tror att dessa positivt laddade radikaler kan spela en avgörande roll i bindningsaktiviteten hos dendrotoxiner, eftersom de kan interagera med anjoniska ställen (negativt laddade aminosyror) i kaliumkanalernas porer.
En molekyl av dendrotoxin binder reversibelt till kaliumkanalen för att utöva en hämmande effekt. Det antas att denna interaktion initieras av elektrostatiska interaktioner mellan de positivt laddade aminosyraradikalerna i dendrotoxinets katjoniska region och de negativt laddade radikalerna i jonkanalernas porer . Kaliumkanaler, liksom andra katjonselektiva kanaler, har förmodligen ett moln av negativa laddningar framför kanalens porinlopp som hjälper till att styra kaliumjoner längs genomträngningsvägen. Det antas allmänt (men inte bevisat) att dendrotoxinmolekyler binder till anjoniska bindningar nära den extracellulära ytan av kanalen och fysiskt stänger porerna, och förhindrar därigenom jonledning. Emellertid har Imready och McKinnon [4] föreslagit att delta-dendrotoxin kan ha ett avvikande bindningsställe på målproteiner och kan hämma kanalen genom att ändra dess struktur snarare än att fysiskt blockera porerna.
Många studier har syftat till att bestämma de aminosyraradikaler som krävs för bindningsverkan av dendrotoxiner på riktade kaliumkanaler. Harvey et al [5] använde specifika radikalinriktade modifikationer för att identifiera positivt laddade radikaler som är kritiska för den blockerande aktiviteten av l-dendrotoxin. De rapporterade att acetylering av Lys5 nära aminoterminalen och Lys29 nära β-svängregionen resulterade i en signifikant minskning av l-dendrotoxinbindningslikheten. Liknande resultat erhölls för K-dendrotoxin med användning av mutagenes för att ersätta positivt laddade lysin- och argininrester med neutrala alaniner . Dessa resultat, tillsammans med många andra, tyder på att de positivt laddade lysinradikalerna i aminohalvan, i synnerhet Lys5 i 3 10 helixen , spelar en mycket viktig roll i bindningen av dendrotoxin till riktade kaliumkanaler. Lysinrester i β-omsättningsregionen gav mer blandade resultat, som visade sig vara biologiskt kritiska i vissa dendrotoxinhomologer och valfria i andra. Dessutom resulterade mutation av hela lysintrio (K28-K29-K30) till Ala-Ala-Gly i α-dendrotoxin i mycket små förändringar i biologisk aktivitet.
Det råder allmän enighet om att den konserverade lysinradikalen nära aminoterminalen (Lys5 i α-dendrotoxin) är avgörande för den biologiska aktiviteten hos alla dendrotoxiner, medan ytterligare radikaler som de i β-omsättningsregionen kan spela en roll i specificiteten av dendrotoxinet genom att förmedla interaktioner mellan enskilda toxiner på deras individuella målområden. Detta hjälper inte bara till att förklara den starka specificiteten hos vissa dendrotoxiner för olika undertyper av spänningsstyrda K+-kanaler , utan förklarar också skillnaderna i styrka hos dendrotoxiner till normala K + -kanaler . Till exempel visade Wang och andra forskare [6] att interaktionen mellan K-dendrotoxin och K V 1.1 tillhandahålls av dess lysinradikaler både i aminoterminalen och i β-svängregionen, medan α-dendrotoxin uppenbarligen interagerar med dess mål enbart på bekostnad av aminoterminalen. Detta mindre omfattande interaktionsområde kan hjälpa till att förklara varför α-dendrotoxin är mindre diskriminerande medan K-dendrotoxin är mycket selektivt för KV 1.1 .
Kaliumkanalerna hos ryggradsdjursneuroner har många varianter som gör att de kan finjustera egenskaperna hos sina elektriska signaler genom att manifestera olika kombinationer av kaliumkanalundergrupper. Dessutom, eftersom de reglerar rörelsen av joner över biologiska membran, är de viktiga i många aspekter av cellulär reglering och signalering över celltyper. Därför är spänningsstyrda kaliumkanaler mål för ett brett spektrum av potenta biologiska toxiner från djur som ormar, skorpioner , havsanemoner och konsniglar . Således ledde rening av giftet till isolering av peptidtoxiner, såsom dendrotoxin, som har blivit användbara farmakologiska verktyg för att studera kaliumkanaler. På grund av deras aktivitet och selektivitet för olika kaliumkanalsubtyper har dendrotoxiner blivit användbara som molekylära prober för strukturell och funktionell analys av dessa proteiner. Detta kan hjälpa till att förstå vilka roller enskilda kanaltyper spelar, samt hjälpa till att klassificera de olika kanaltyperna [7] . Dessutom ger förekomsten av radioaktivt märkta dendrotoxiner ett verktyg för att utforska andra källor på jakt efter nya gifter som verkar på kaliumkanaler, såsom kalicludinklassen som finns i havsanemoner. Slutligen kan den strukturella informationen från dendrotoxin ge ledtrådar till syntesen av läkemedelsföreningar som kan verka på vissa klasser av kaliumkanaler.