The Long-Term E. coli Evolution Experiment är ett unikt experiment på utvecklingen av bakterien Escherichia coli in vitro av ett team ledd av Richard Lensky vid University of Michigan . Under experimentet spårades genetiska förändringar som inträffade i 12 E. coli- populationer över mer än 60 000 generationer. Experimentet började den 24 februari 1988 och har pågått i över 30 år [1] [2] .
Under experimentet upptäcktes ett brett spektrum av genetiska förändringar. De mest betydande anpassningarna var förmågan att assimilera natriumcitrat som förekom i en av populationerna , såväl som uppkomsten av polymorfa samhällen genom att dela upp kolonin i separata samexisterande och självständigt utvecklande populationer.
Syftet med experimentet var att hitta svar på några viktiga frågor inom evolutionsbiologin [3] :
Valet av E. coli- bakterien förklaras av den snabba generationsväxlingen i denna organism och genomets ringa storlek, vilket gör det möjligt att på kort tid studera processer som tar årtusenden i mer komplexa organismer. På grund av det faktum att denna bakterie har använts i molekylärbiologi i årtionden är den väl studerad och teknikerna för att arbeta med den är väl avlusade. En bakterie kan förbli frusen under lång tid utan förlust av livsduglighet, vilket gör det möjligt att hålla en slags "krönika av experimentet", och avfrostning av den önskade generationen gör det möjligt att vid behov upprepa experimentet från vilken som helst tidigare sparad punkt .
"Bc251-stammen" som beskrevs 1966 av Seymour Lederberg togs som stamstammen av E. coli. [4] och användes av Bruce Levin i experiment på bakteriologisk ekologi 1972 . Karakteristiska egenskaper hos denna stam var T6 r (resistens mot bakteriofag T6), Str r (resistens mot streptomycin ), r - m - ( restriktions- och modifieringsaktiviteter är inaktiverade), Ara - (oförmåga att absorbera arabinos ) [5] . Innan experimentet startade, genom punktmutation av ara -operonet , beredde Lenski en Ara + -variant av denna stam med förmåga att assimilera arabinos.
I början av experimentet skapades 12 populationer av den initiala stammen (6 populationer av Ara + och 6 Ara − , betecknade A+1 … A+6 respektive A−1 … A−6). Genetiska markörer användes för att exakt identifiera varje population. Varje population föds upp i en artificiell miljö, där reproduktionshastigheten begränsades av stressförhållanden (brist på den huvudsakliga livsmedelsprodukten - glukos ). Varje dag överfördes 0,1 ml av innehållet i varje rör till ett rör med 10 ml färskt näringsmedium, där bakterier fortsatte att växa. Var 500:e generation (motsvarande ett intervall på 75 dagar ) frystes i glycerol vid -80 °C , så att det i framtiden, med tillkomsten av nya analysmetoder, skulle vara möjligt att genomföra en mer detaljerad studie. Under experimentet sekvenserades arvsstammens arvsmassa fullständigt, såväl som genomen från vissa stadiumgenerationer (generationerna 2000 , 5000 , 10000 , 15000 , 20000 och 40000 ) [6] .
Eftersom storleken på E. coli -genomet är 4,6 miljoner baspar, vid den observerade mutationshastigheten (cirka 1000 basparbyten per dag), ersätts varje baspar i genomet i genomsnitt mer än en gång på 20 år [7] . Inte alla mutationer som förekommer i genomet är lika. Användbarheten av en mutation bestäms av graden av reproduktion av deras bärare. En ökad reproduktionshastighet gör att den muterade bakterien kan tränga undan bakterier med den saknade mutationen från befolkningen. I detta fall är mutationen "fixerad" och finns i arvsmassan hos alla efterföljande generationer. Skadliga mutationer verkar på motsatt sätt. Det finns också "neutrala" mutationer som inte påverkar hastigheten för bakteriell reproduktion, eftersom de förekommer i obetydliga regioner av genomet. Dessa mutationer är inte fixerade eller förträngda genom selektion och uppträder och försvinner således slumpmässigt.
Experimentet använde E. coli -linjen , som reproducerar uteslutande genom fission (utan sexuell process). Således var utbudet av fenomen som studerades begränsad till nyligen uppkomna mutationer [3] .
Davis minimala näringsmedium [8] med en glukoskoncentration på 25 mg/l, kallat DM25, användes i experimentet. Detta medium ger en densitet på 50 miljoner bakterier/ml i den stationära fasen [9] .
Odlingsvolymen var 10 ml . Kulturer hölls i 50 ml koniska kolvar löst täckta med inverterade glasbägare. Inkubationen ägde rum vid en temperatur av 37°C och en rotationshastighet av 120 rpm . Efter en dag överfördes 0,1 ml av kulturen till en kolv med 9,9 ml färskt medium.
Sammansättningen av DM25-medium (per 500 ml injektionsflaska) är som följer:
| Komponent | Formel | Volym | Vikt | Matlagning |
|---|---|---|---|---|
| Kaliumvätefosfat | K2HPO43H2O _ _ _ _ _ _ | 3,5 g | Bered lösningen och autoklavera | |
| Kaliumdivätefosfat | KH2PO4H2O _ _ _ _ _ _ | 1,0 g | ||
| Ammoniumsulfat | ( NH4 ) 2SO4 _ _ | 0,5 g | ||
| natriumcitrat | Na3C6H5O7 _ _ _ _ _ _ _ | 0,25 g | ||
| Vatten | H2O _ _ | 500 ml | ||
| Glukos (10%) | C6H12O6 _ _ _ _ _ | 0,125 ml | 12,5 mg | Efter autoklavering, tillsätt från sterila flaskor |
| Magnesiumsulfat (10%) | MgSO4 _ | 0,5 ml | 25 mg | |
| Tiamin (0,2%) | C12H17N4OS _ _ _ _ _ _ | 0,5 ml | 25 mg |
Det bör noteras att normalt E. coli inte konsumerar natriumcitrat, det används endast som en järnkelator .
Uppsatsen [2] presenterar resultaten av en studie av A-1-populationen, en av 12 som deltog i experimentet. Författarna delar upp befolkningens utveckling i två stadier, vars gräns går ungefär på generation 26 000.
Vid sekvensering av 20 000-generationsgenomet och jämförelse med arvsstammens genom, hittades 45 fixerade mutationer av olika typer (nukleotidsubstitutioner, insättningar, substitutioner, inversioner, infogning av transposerbara element), varav huvuddelen (29) stod för enstaka nukleotidsubstitutioner. Hastigheten för ackumulering av fixerade mutationer under det första steget av experimentet förblev ungefär konstant. Det var oväntat att bakteriernas anpassningsförmåga till miljön, uttryckt i reproduktionshastigheten, växte mycket snabbt fram till generation 1500, sedan avtog dess tillväxt med samma hastighet av fixering av mutationer.
Andra populationer har mindre än 100 fixerade mutationer under de första 20 000 generationerna, varav endast 10 till 20 har varit fördelaktiga [3] .
Mönstret för evolutionär förändring i A-1-populationen förändrades dramatiskt efter generation 26 000. Vid denna tidpunkt inträffade en mutation i mutT -genen , som kodar för ett protein som är involverat i DNA-reparation . Som ett resultat ökade det genomsnittliga antalet fixerade mutationer dramatiskt till 0,05 per generation (jämfört med 0,002 i det första steget). Totalt registrerades 609 mutationer i generationer 20 000–40 000. En liknande ökning av mutageneshastigheten observerades i tre andra populationer av 12.
Resultatet av utvecklingen av A-3-populationen visade sig vara oväntat. Vid tidpunkten motsvarande generation 33127 märktes en kraftig grumlighet i kolven, vilket tyder på en hög täthet av bakterier. En liknande effekt observerades vanligtvis när kulturen var kontaminerad med bakterier av en annan art som konsumerar natriumcitrat. Eftersom koncentrationen av natriumcitrat i mediet (500 mg/l) är 20 gånger högre än koncentrationen av glukos (25 mg/l) ger citratkonsumtion en betydligt högre celltäthet [7] .
Oförmågan att livnära sig på citrater i en syremiljö är ett karakteristiskt drag hos E. coli . Studien visade dock att det är mutanta E. coli -bakterier ( Cit + -bakterier) som konsumerar natriumcitrat. Verifiering av genetiska markörer, såväl som närvaron av pykF- och nadR-mutationer som är karakteristiska för tidigare generationer av A-3, bekräftade att Cit + -bakterier inte introducerades utifrån, utan var muterade individer av den ursprungliga stammen [7] .
En retrospektiv undersökning av frysta prover visade att det inte finns några Cit + -bakterier alls i 31 000 generationen , 0,5 % i 31 500 generationen och 15 och 19 % i 32 000 respektive 32 500 generationerna. I 33 000- generationen försvinner Cit + praktiskt taget (1,1%), men i 33 500- generationen återtar de också oväntat sitt livsrum och dominerar helt i efterföljande generationer. Forskarna tillskriver detta uppkomsten mellan generationer 33 000 och 33 500 av någon ännu oidentifierad mutation, som i kombination med förmågan att livnära sig på citrat gav Cit + -bakterier en evolutionär fördel [7] .
Hypotesen testades att förmågan att assimilera citrat (även om det är mindre effektivt än glukos) ursprungligen fanns i bakterier, men denna egenskap visade sig inte tydligt före uppkomsten av samtidiga mutationer. Hypotesen bekräftades inte, eftersom bakterier upp till den 31 000 :e generationen inte kunde föröka sig i en miljö utan glukos [7] .
År 2017, när experimentet hade pågått i 29 år, fann man oväntat att i 9 av 12 populationer hade ekologisk diversifiering inträffat. Den ursprungliga monokulturen splittrades i separata populationer, som fortsatte att utvecklas separat utan att tränga ut varandra [10] [11] .
Experimentets första uppgift var att observera utvecklingen av bakteriesamhället under extremt enkla omständigheter - i en konstant miljö, med en enda källa till mat, utan genetiskt utbyte och ekologisk interaktion mellan organismer. Men med tiden inträffade en spontan komplikation av befolkningen med uppkomsten av separata ekologiska nischer. Det enklaste exemplet på denna typ av separation är bildandet av två mikrobiella samhällen, som var och en har sin egen typ av metabolism, där avfallsprodukter från en annan gemenskap används. Denna effekt märktes först 2014 i en av populationerna (Ara-2) [12] , och 2017 återfanns den i 9 av 12 populationer. Evolution sker inte på skalan av populationen som helhet, utan i varje av bakteriesamhällena. Under dessa förhållanden förlorar reproduktionshastigheten av bakterier som en indikator på graden av kondition delvis sin mening, eftersom fitness nu beror på effektiviteten av interaktion med andra samhällen.
Det noterades att i de tidiga och sena stadierna av anpassningen inträffade den mest intensiva fixeringen av mutationer i olika gener. Detta fenomen beror på tre faktorer:
Experimentet förstörde således de tidigare idéerna om anpassningen av den asexuella befolkningen till stabila miljöförhållanden. Tvärtemot förväntningarna finns det praktiskt taget ingen avmattning i den adaptiva evolutionen, och när en viss grad av anpassning av befolkningen till miljön uppnås, uppstår en spontan komplikation av befolkningens struktur.