Calponin ( eng. Calponin ) är en medlem av familjen av aktinbindande proteiner, typiskt främst för glatta muskelceller som binder G- och F- aktin . Kalponiner är produkten av 3 gener och delas in i den så kallade α-kalponin (h1 eller basisk, 292 a.k. , 34 kDa), β-kalponin (252 a.k.) - som är produkten av samma gen som α-kalponin men med en deletion av aminosyror i segmentet 216-256. Två andra isoformer, neutralt kalponin (h2-kalponin) och surt kalponin, uttrycks i glatt muskulatur och icke-muskelceller. Andra representanter för kalponiner är SM22 och transgelin. Calponin har fått sitt namn från CH- eller Calponin Homology-domänen, som finns bland många ABP ( aktinbindande proteiner ). Trots detta faktum visar inte kalponin aktinbindning genom detta ställe (Gimona och Mital, 1998), utan binder istället lipider (Bogatcheva och Gusev, 1995; Fujii et al., 1995). Aktinbindningsstället tros (Mezgueldi et al., 1992) vara beläget i området mellan CH-domänen och kalponinliknande upprepningar (CLIK - kalponinliknande upprepning). Calponin är termostabilt. Molekylvikten för den glatta muskelisoformen är 34 kDa. Andra vävnader presenterar surare kalponinisoformer som inte binder kalcium , utan binder kalmodulin . Bindning av Ca2 + /calmodulin hämmar bindning till aktin. Fosforylering av kalponin av serin-treoninkinaser leder till en liknande effekt . Calponin har också ett tropomyosin - bindningsställe.
Calponin är ett aktin-, calmodulin- och tropomyosinbindande protein som har hittats i den glatta muskelvävnaden hos flera ryggradsdjur och i vissa icke-muskelceller. Under beredningen av tunna kycklingmagfilament visades det att de innehåller aktin, tropomyosin, caldesmon och calponin i ett molförhållande av 7:0,9:0,6:0,7. Liksom caldesmon hämmar kalponin aktomyosin- ATPas - aktivitet i lösning, glidande aktin i förhållande till fosforylerat myosin in vitro , och denna hämning utlöses av Ca2 + /calmodulin. Hämningen avskaffas genom proteinfosforylering in vitro . Dessa egenskaper tyder på att kalponin kan vara en ytterligare regulator av aktin-myosin-interaktioner.
Fullständig eller partiell kymotryptisk nedbrytning av kalponin utförs vid 25°C med ett viktförhållande mellan proteas och substrat av 1:100 respektive 1:1000, i 10 mM imidazol- HCl , 30 mM NaCl , 2 mM MgCl2 , 2 mM MgCl2 NaN3 , pH 7,0, i frånvaro eller närvaro av F-aktin (4 mg/ml) (molförhållande aktin/kalponin = 3:1). Vid lämpliga tidsintervall (0-60 min) blandas väldefinierade mängder proteiner med en lika stor volym av Laemmlis kokande provbuffert och prepareras för gelelektrofores . För tvärbindningsreaktioner och bindningsexperiment avslutas digerering med 2,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) . Total hydrolys av det kovalenta kalponin-aktinkomplexet (11 mg/ml) med CNBr (67 mg/ml tillsatt i två lika mängder) utförs under 24 timmar i 70 % myrsyra innehållande 14 mM p-merkaptoetanol.
Kalponin (0,7-1,3 mg/ml) i 10 mM imidazol-HCl, 30 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 4 mM NaN3, pH 7,0, blandat med nativt eller subtilisin-klyvt F-aktin (2,4-4,5 mg/ml) ( molförhållande kalponin/aktin = 1:3) i närvaro av 2 mM EDC och 5 mM NHS. Reaktionen utfördes vid 25°C under 0-30 min och övervakades med SDS-gelelektrofores. Caldesmon (1,4 mg/ml) tvärbinder till F-aktin under samma betingelser med användning av ett proteinmolförhållande på 1:6. Den kovalenta bindningen mellan F-aktin och det 22 kDa NH2-terminala kymotryptiska fragmentet av kalponin erhålls enligt följande: 60 min kymotryptisk nedbrytning av kalponin, vid ett viktförhållande mellan enzym och substrat på 1:1000, kompletteras med F-aktin vid ett molförhållande av 1:3, efter centrifugering vid 180 000 x g under 1 timme vid 4°C, återsuspenderas pelleten i imidazol-HCl, pH 7,0, buffert. För den preparativa separationen av 76 kDa F-aktin-kalponinaddukten från icke- tvärbunden kalponin, justerades en lösning av tvärbundet F-aktin-kalponin (110 mg protein) erhållen efter 45 minuters reaktion i 3 mM β-merkaptoetanol, dialyserad över natten vid 4°C mot depolymeriserande buffert (50 mM Tris-HCl, 0,6 m KI, 5 mM natriumtiosulfat, 0,5 mM ATP , 0,5 mM CaCl2 och 0,5 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5), och sedan filtreras gelén genom en kolonn av Sephacryl-S-300 (1,6 x 120 cm), ekvilibrerad vid 4°C i samma buffert. De initiala proteinfraktionerna elueras innehållande en 76 kDa-addukt som saknar fritt kalponin, analyserat med gelelektrofores. De sammanslagna fraktionerna dialyseras med destillerat vatten, lyofiliseras och utsätts för CNBr- uppslutning .