Konjugering (från latin conjugatio - anslutning) - enkelriktad överföring av en del av det genetiska materialet ( plasmid eller bakteriell kromosom ) med direkt kontakt av två bakterieceller. Upptäcktes 1946 av Joshua Lederberg och Edward Tatum [1] . Fenomenet konjugering upptäcktes och studerades väl i E. coli ( Escherichia coli ), men senare beskrevs konjugering i en mängd både grampositiva och gramnegativa bakterier . Genom konjugering utbyter bakterier genetiskt material och behåller sin genetiska mångfald .
Förekomsten av konjugering i bakterier visades 1946 av Joshua Lederberg och Edward Tatum. De blandade två stammar av E. coli Escherichia coli , auxotrofa (kan inte existera på ett medium utan en viss substans) för olika ämnen, inkuberade den resulterande kulturen i flera timmar i ett medium som innehöll alla nödvändiga näringsämnen och sådde cellerna på skålar med ett minimalt medium. För att undvika att förvränga de experimentella data genom att vända några av de mutationer som är ansvariga för auxotrofi, använde de dubbla och trippel auxotrofer. På grund av detta var möjligheten för uppkomsten av celler som inte är auxotrofa för alla tre föreningarna på grund av återgången av mutationer extremt låg. När kolonier dök upp på plattorna drog forskarna slutsatsen att bakterierna hade utbytt gener som återställde den normala fenotypen . Lederberg och Tatum bevisade dock inte att DNA överfördes mellan bakterier genom direkt fysisk kontakt. Detta gjordes av Bernand Davis 1950. Han designade ett U-format rör, delat på mitten av ett septum, genom vilket mediet kunde passera, men inte bakteriecellerna. Därefter inkuberade Davis flera auxotrofa stammar i röret och blandade mediet kraftigt. Inga kolonier uppträdde efter sådd av cellerna på det minimala mediet. Således visades det att fysisk kontakt mellan två celler var nödvändig för det DNA-utbyte som upptäckts av Lederberg och Tatum. Därefter beskrevs konjugering även i andra bakterier, inklusive grampositiva bakterier som Bacillus subtilis [2] . Konjugering är dock den mest studerade i E. coli [3] , vars mekanism diskuteras i detalj nedan.
Konjugering förstås som överföring av DNA mellan bakterieceller under deras direkta kontakt. Som regel överförs plasmider under konjugering , men i vissa organismer kan kromosomalt DNA också överföras. Under konjugering sker en enkelriktad överföring av genetiskt material från donatorcellen till mottagarcellen [4] . Konjugationsprocessen diskuteras nedan med användning av exemplet med E. coli , det vill säga i gramnegativa bakterier; konjugering i grampositiva bakterier diskuteras i avsnittet Konjugering i andra bakterier .
I den överväldigande majoriteten av fallen är konjugering endast möjlig när donatorcellen har en plasmid som innehåller generna som säkerställer DNA-överföring. I E. coli och andra gramnegativa bakterier tillhandahålls fysisk kontakt mellan två celler av sex pili , ihåliga proteinstrukturer på cellytan. Strukturen hos sexpili är mycket varierande: F-plasmidkodade pili är långa, tunna och flexibla, medan RP4-kodade pili är korta, tjocka och stela. Pili interagerar med receptorer på ytan av mottagarcellen, på grund av vilka de konjugerande cellerna bildar ett par. Mekanismen för cellparbildning under konjugering är mycket lik det bakteriella typ IV-sekretionssystemet , genom vilket vissa patogena bakterier levererar toxiner direkt till värdcellen [5] .
Överföringen av DNA genom en högkontakt börjar när ett specifikt protein introducerar en enkelsträngsbrytning ( smeknamn ) i en specifik region av överföringsplasmiden som kallas överföringsursprunget ( oriT ). Helicase , som kodas av den överförda plasmiden, lindar upp plasmid-DNA:t och den skurna strängen överförs till mottagarcellen med dess 5'-ände framåt. Parallellt med detta förlängs dess 3'-ände, vilket fyller på den utgående strängen i donatorplasmiden enligt den rullande ringreplikationsmekanismen . Enkelsträngat DNA som överförs till mottagarcellen fullbordas också till dubbelsträngat. Konjugering är alltså en replikativ process och strängt taget överförs inte plasmiden själv, utan dess kopia [6] .
Långt ifrån alla plasmider kan överföras mellan celler som beskrivs ovan (de kallas konjugativa; till exempel är F-plasmiden i E. coli en ). Ibland underlättar den konjugativa plasmiden överföringen av den icke-konjugativa plasmiden till mottagarcellen genom en process som kallas mobilisering. Som ett exempel, betrakta mobiliseringen av den icke-konjugativa plasmiden ColE1 . Den innehåller mob -genen som kodar för ett specifikt nukleas och bomstället (liknande oriT ), och Mob-proteinet introducerar ett enkelsträngsbrott i plasmiden. I själva verket, för att vara konjugativ, saknar ColE1-plasmiden de gener som skulle koda för DNA-överföringsapparaten, så den kan överföras till mottagarcellen genom överföringsapparaten som kodas av den konjugativa plasmiden. Ibland kanske en mobiliserad plasmid inte har sin egen mob -gen , och en enkelsträngsbrytning introducerar Mob-proteinet från en närbesläktad plasmid i den [7] .
I de allra flesta fall överförs plasmid-DNA under konjugering. Vissa bakterier kan dock också överföra kromosomalt DNA. Till exempel kan fragment av genomiskt DNA passera tillsammans med F-plasmiden i E. coli , och andra bakterier, såsom Pseudomonas aeruginosa , har liknande system . I vissa fall kräver överföringen av kromosomalt DNA integrering av plasmiden i bakteriens genomiska DNA, så att det genomiska DNA:t faktiskt överförs som en del av plasmiden. Emellertid är fall kända när kromosomalt DNA överförs i fri form, förmodligen genom en mekanism som liknar mobiliseringen av icke-konjugativa plasmider [7] .
När en plasmid överförs under konjugering får mottagarcellen en komplett enkelsträngad version av plasmiden, men det kromosomala DNA:t överförs inte i sin helhet på grund av att dess fullständiga överföring skulle kräva avsevärd tid. Således skulle det ta 100 minuter att överföra en komplett kromosom i E. coli (medan det tar 1 minut att överföra en 40 kb plasmid ) . Ett fragment av genomiskt DNA överfört till en mottagarcell kan användas sist för rekombination [8] .
År 1952 visade William Hayes att DNA-överföringen som beskrevs av Lederberg och Tatum var polär. Med andra ord deltog donatorcellen (F + från engelska fertility - "fertility") och mottagarcellen (F - ) i överföringen. Det visade sig att cellerna i F + -stammen innehåller den så kallade F-plasmiden [9] . F-plasmiden kan vara i cellen i två tillstånd: fri eller integrerad i genomet (episomal) [10] .
När F + -celler och F - -celler korsas, förlorar donatorcellen inte sin F + -status, men F - -cellen förvärvar det. Med en sådan korsning går auxotrofi sällan förlorad, eftersom mottagarcellen endast tar emot F-plasmid-DNA utan genomiskt DNA [9] .
En annan situation uppstår när F - -cellen konjugerar med en cell i vilken F-plasmiden har integrerats i genomet. Sådana celler med en F-plasmid insatt i genomet kallas Hfr från engelska. hög frekvens av rekombination , eftersom när de överförs, mottar mottagarcellen ofta ett fragment av genomiskt DNA, som den använder för rekombination. När F-plasmiden integreras i genomet förblir alla gener som krävs för DNA-överföring, såsom gener som kodar för pili-proteiner, funktionella. I början av konjugationen mellan Hfr- cellerna och F - cellen, introduceras ett enkelsträngsbrott i oriT- stället för den integrerade F-plasmiden, och DNA:t börjar passera in i mottagarcellen, dock endast ett fragment av F-kromosomen kommer in i den först, följt av genomiskt DNA. Som nämnts ovan tar det cirka 100 minuter att överföra ett komplett genom, så partnerbakterier bryter kontakten innan allt genomiskt DNA hinner överföras. Eftersom mottagaren sällan får en komplett kopia av F-plasmiden förblir han en F - cell [11] .
Eftersom F-plasmiden integrerad i genomet är en episom kan den lämna bakteriegenomet och återställa dess autonoma status. Men ibland uppstår ett misstag när en kromosom skärs ut, och det tar en liten bit av genomiskt DNA med sig. En sådan plasmid kallas en F'-plasmid. Eftersom F'-plasmiden fortfarande innehåller alla gener som krävs för konjugering, förblir den konjugativ och kan överföras till F - cellen med en rullande ringmekanism. När konjugeringen är fullbordad blir mottagarcellen emellertid delvis diploid ( merozygot ), eftersom de delar av genomet som F'-plasmiden introducerade i den nu finns i den i en dubbel uppsättning. Konjugationen som förmedlas av F'-plasmiden kallas ibland för sexduktion. Det bör noteras att rekombination kan ske mellan homologa regioner på F'-plasmiden och mottagarens kromosom [12] . Genom F'-plasmider kan bakteriegener snabbt spridas i populationer [13] .
Många proteiner är involverade i konjugationsprocessen. Ett enkelsträngsbrott i oriT- regionen och den initiala avvecklingen av DNA-strängarna producerar ett proteinkomplex som kallas relaxosomen [14] . Hos E. coli är sexpili i huvudsak ett typ IV-sekretionssystem. Den består av många kopior av Tra-proteinerna, inklusive TraA, som bildar pilen, och TraD, som tillhandahåller energi för processen genom ATP -hydrolys . Vissa Tra-proteiner finns i cellmembranet , några fortsätter in i det periplasmatiska utrymmet och passerar genom peptidoglykanskiktet och når det yttre membranet och dess lipopolysackaridskikt [ 13] .
F-plasmiden innehåller en specifik regulatorisk region, som i synnerhet inkluderar traJ -genen . TraJ-proteinet reglerar positivt uttrycket av andra tra- gener som krävs för bildandet och funktionen av sexpili. Antisens-RNA :t FinP och FinO bildar ett FinOP-komplex, som undertrycker bildandet av TraJ-proteinet och därmed är en hämmare av konjugation. Ytterligare fem system för att hämma överföringen av F-plasmider och F-liknande plasmider till mottagarcellen har beskrivits. Bland dessa system är finW lokaliserad i den F-liknande plasmiden R455, finQ-, finU- och finV-systemen finns i ett antal icke-F-liknande plasmider, och finC-systemet är lokaliserat i multikopiamutanten av den icke- konjugativ plasmid CloDF13. Alla dessa system reglerar på något sätt tragenerna . F-plasmiden i sig kan också hämma överföringen av andra plasmider: till exempel hämmar den överföringen av RP4-plasmiden med 500–1000 gånger [15] .
Värdcellsgener kan också påverka den konjugativa överföringen av plasmider. Till exempel hittades sfrA- och sfrB-generna , som reglerar vissa tra- gener, i genomet av E. coli -stam K-12 . Dessutom minskar mutationer i den genomiska genen fex den konjugativa potentialen hos F-plasmiden [16] .
En cell som innehåller en konjugativ plasmid i en eller annan form kan inte fungera som en mottagare under konjugering. Detta fenomen kallas ytuteslutning och beskrevs först i F-plasmiden, som bäst studeras. Generna som är ansvariga för ytuteslutning betecknas Sfx. Sådana gener har identifierats i F-plasmiden och flera F-liknande plasmider, såsom R100. Fem grupper av plasmider är kända, som skiljer sig i termer av ytuteslutning. Representanter för dessa grupper är plasmiderna F, ColB2-K98, R1, R100 respektive pED208. Ibland klassificeras ett antal F-liknande plasmider i den sjätte gruppen på basis av Sfx. Men även om plasmiderna tillhör olika grupper på basis av Sfx kan man inte villkorslöst tala om ytlig uteslutning och omöjligheten av konjugering. Det har visat sig att ytinkompatibilitet i de flesta fall är förknippat med särdragen hos sexsågar [17] .
Konjugationsmekanismen som beskrivs ovan gäller gramnegativa bakterier. Men många grampositiva bakterier kan konjugera, från Streptomyces till Enterococcus . I många av dessa fall är DNA-överföringsmekanismen i grunden lik den för gramnegativa bakterier. Men medan det i gram-negativa bakterier krävs minst 20 gener för konjugering, i gram-positiva bakterier är betydligt färre gener involverade i konjugering, ibland så få som fem. Därför är de konjugativa plasmiderna av grampositiva bakterier ofta mindre än de från gramnegativa bakterier. På grund av cellväggens strukturella egenskaper (tjockt peptidoglykanlager) är pili inte involverade i konjugering i grampositiva bakterier. Konjugationssystemet har studerats tillräckligt i den grampositiva bakterien Enterococcus faecalis . Vissa stammar av denna art utsöndrar lösliga feromoner av peptidkaraktär som stimulerar uttrycket av tra- generna på de konjugativa plasmiderna från närliggande celler (märkligt nog utsöndras feromonerna i det här fallet av mottagarna av det genetiska materialet, och inte vice versa , som vanligtvis är fallet). I donatorceller som innehåller en konjugativ plasmid finns feromonreceptorer på ytan och olika plasmider motsvarar olika feromoner och följaktligen olika receptorer. Efter bindning till receptorn levereras feromonet till cytoplasman av ett speciellt protein, och i cytoplasman interagerar feromonet med TraA-proteinet. I sin fria form undertrycker detta protein uttrycket av tra- proteiner , och när det binds till ett feromon förlorar det sina hämmande egenskaper och uttrycket av tra- gener aktiveras. Som ett resultat bildas en komplex proteinaggregation som förbinder donator- och mottagarcellerna [18] .
I E. faecalis är konjugering möjlig, förmedlad inte av plasmider, utan av en transposon , Tn 916 . Den innehåller ett oriT-ställe som liknar det för plasmider. I början av konjugeringen skärs Tn 916 ut från bakteriekromosomen av två enzymer som den kodar för, Int och Xis, som är relaterade till enzymerna som skär ut bakteriofagen λ . Vidare tar den en cirkulär form och liknar den konjugativa plasmiden, eftersom den innehåller oriT- och tra - generna . Samtidigt, även i ringformen, har Tn 916 inget replikationsursprung och är därför oförmöget att fördubblas. Mekanismen för DNA-överföring i fallet med Tn 916 liknar den för konjugativa plasmider. När en dubbelsträngad cirkulär form av ett transposon bildas i en mottagarcell, infogar integrasenzymet det i en slumpmässig region av bakteriegenomet. Tn 916 är prototypen för en grupp besläktade konjugativa transposoner i Gram-positiva kocker , även om konjugativa transposoner också har beskrivits i Gram-negativa bakterier. Tillsammans med plasmider kan konjugativa transposoner också bidra till spridningen av antibiotikaresistens : till exempel innehåller Tn 916 tetracyklinresistensgenen [19] .
Efter upptäckten av Hfr- stammar föreslog Ellie Volman och François Jacob en ny metod för att kartlägga den bakteriella kromosomen - metoden för korsningsavbrott. De blandade F + - och F - celler i en kultur , som bar vissa kromosomala markörer, inkuberade dem under en tid, sedan genom kraftig skakning, förstörde kontakter mellan celler, avbröt konjugering och utvalda celler i vilka rekombination inträffade. Genom att avbryta konjugering vid olika tidsintervall och bestämma vilka gener som överfördes och vid vilken minut efter start av konjugation är det möjligt att fastställa generernas ordning, det vill säga att kartlägga dem på bakteriekromosomen [20] .
| Mikrobiologi : Bakterier | |
|---|---|
| Patogena bakterier |
|
Mänsklig mikroflora |
|
| Substratspecificitet _ | |
| Andetag | |
| Genetik och reproduktion | |
| vilande former |
|
| se även | |