Öppet kromatin ( engelska open chromatin ) - små ytor av kromatin , fria från nukleosomer [1] . Plantering av nukleosomer förhindras i allmänhet av kromatinassocierade proteinfaktorer som känner igen vissa DNA-sekvenser . Dessa proteiner inkluderar transkriptionsfaktorer , DNA- eller RNA- polymeraser . Öppet kromatin sammanfaller ofta med cis-regulatoriska sekvenser , nämligen: promotorer , förstärkare , isolatorer , ljuddämpare , ursprungsställen för DNA-replikation [2] . Storleken på öppna delar av kromatin är vanligtvis flera hundra baspar , i genomsnitt cirka 300 bp [3] .
Öppet kromatin bestäms oftast med DNase-känslighetsmetoden. Nukleosomfria regioner av kromatin attackeras företrädesvis av DNas I när permeabiliserade celler eller isolerade kärnor behandlas med det . I detta avseende hänvisas öppet kromatin ofta till som DNas I- överkänsliga ställen eller överkänsliga ställen . Sannolikheten för DNA-klyvning av nukleas på överkänsliga ställen kan överstiga genomsnittet med hundratals och till och med tusentals gånger. Överkänslighet mot öppet kromatin-DNas I bör särskiljas från ökad generell DNas-känslighet hos aktivt transkriberade gener [4] .
Beroende på typen av proteinfaktorer vars bindning till DNA förhindrar nukleosomlandning, kan DNas I-överkänsliga kromatinregioner vara vävnadsspecifika eller konstitutiva, det vill säga närvarande i celler differentierade längs olika vägar.
För att kartlägga områden med öppet kromatin används DNas -känslighet ( DNase I-överkänslig ) och isolering av regulatoriska element med formaldehyd . formaldehyd-assisterad isolering av regulatoriska element (FAIRE) [1] . DNase-känslighetsmetoden tillåter inte att bestämma vilken regulatorisk plats detta område av öppet kromatin är [1] .
Tidigare utfördes analysen av resultaten av DNas-känslighetsmetoden med användning av Southern blot- hybridisering ( eng. Southern blot ). Detta tillät oss inte att analysera ett stort antal webbplatser, samt att hitta nya platser med överkänslighet. DNas-känslighetsanalys kan också utföras med realtids- PCR (kvantitativ PCR). Detta är mycket enklare än Southern blot-hybridisering, men denna metod har också ett begränsat antal platser för analys och kan inte användas för en genomomfattande studie av fördelningen av DNas I-känslighetsställen [5] .
Utvecklingen av high - throughput sekvensering och DNA -microarray- metoder gör det möjligt att kartlägga öppna kromatinregioner i hela genomet [ 6 ] . Dessutom ger kombinationen av DNase-känslighetsmetoden med Chromatin Immunoprecipitation ( ChIP) -metoden följt av high-throughput-sekvensering mer information om bindningen av specifika transkriptionsfaktorer till aktiva kromatinplatser [1] .
Ett annat sätt att kartlägga områden med öppet kromatin är att utföra kromatinimmunoutfällning ( ChIP ) för antikroppar mot histoner . Samtidigt bör öppna kromatinregioner vara dåligt representerade, eftersom nukleosomer inte är associerade med dem. Metoden för DNas-känslighet och histonimmunfällning ger liknande resultat [7] .
I eukaryota genom är icke-kodande sekvenser involverade i regleringen av genuttryck vid olika utvecklingsstadier av en organism eller i olika vävnader av särskild betydelse. Upptäckten och karakteriseringen av regulatoriska regioner blir avgörande för att förstå mönster i genuttryck [5] . Så i det mänskliga genomet är mer än 95% av DNA icke-kodande . Denna klass av sekvenser, förutom skräp-DNA , inkluderar viktiga regulatoriska sekvenser: promotorer, förstärkare, ljuddämpare, isolatorer eller kontrollloci ( locus control regions (LCR) ) . ENCODE-konsortiet har visat att DNas I-överkänslighetsställen identifierade i 1% av det mänskliga genomet är markörer för histonmodifieringar , tidiga replikationsställen , transkriptionsstartställen och transkriptionsfaktorbindningsställen [ 8] . Dessutom är öppet kromatin ofta associerat med aktivt transkriberade icke-kodande RNA [8] .
Förutom icke-kodande regulatoriska sekvenser är öppet kromatin också associerat med exoner och introner av aktivt transkriberade gener. Särskilt ofta sammanfaller sådana områden med öppet kromatin med genens första exon och intron [5] . Närvaron av öppet kromatin är emellertid inte ett tillräckligt villkor för genaktivitet. Icke-transkriberade gener associerade med öppet kromatin är i ett tillstånd av "beredskap" för transkription ( engelska balanserat tillstånd ) [5] . Sålunda är bildningen av öppet kromatin eller övergången till ett inaktivt tillstånd viktigt för regleringen av genuttryck.
Inte bara bindningsställena för transkriptionsfaktorer och andra regulatoriska proteiner kan vara fria från nukleosomer. Vissa DNA-sekvenser kan inte lindas runt nukleosomala kulor. Dessa är sekvenser som har minskad flexibilitet och sekvenser som tenderar att skapa icke-kanoniska strukturer, såsom hårnålar [9] .
UCSC Genomic Browser - skärmdumpen visar samlokalisering av ett - överkänslighetsklusterställe med promotorer av två gener. Områden med öppet kromatin omges av H3 [ -histoner acetylerade vid den 27:e lysinresten ( H3K27Ac), som är en märkning för aktiva kromatinreglerande regioner såsom promotorer och förstärkare. Dessutom, i regionen för DNase-överkänslighetsstället, finns det ett bindningsställe för många transkriptionsfaktorer, bland vilka man kan hitta den konserverade transkriptionsinitieringsfaktorn TBP (den är huvuddelen av TFIID ). Du kan också märka den frekventa bindningen i denna region av RNA-polymeras II , som utför transkriptionen av proteinkodande gener hos människor . Detta ställe för DNas-överkänslighet kännetecknas av ökad konservatism bland däggdjur ( Eng. Mammal Cons ), vilket innebär att denna sekvens bevaras under evolutionen , och som ett resultat av dess funktionella betydelse [8] .
Bildandet av regioner fria från nukleosomer sker under inverkan av speciella faktorer som utför montering, demontering och rörelse av nukleosomer. Processen att ändra positionen för nukleosomer kallas kromatinremodellering . Det involverar kromatinremodelleringskomplex - konservativa proteinkomplex som arbetar med energiförbrukningen av ATP . Kromatinremodellering utförs efter införandet av vissa epigenetiska märken - histonmodifiering eller DNA-metylering . Om märkena motsvarar aktivt kromatin (till exempel acetylerat 9:e lysin av histon H3, di- och trimetylerat 4:e lysin av histon H3 och många andra), så bildas områden med öppet kromatin. Ofta har profilen för histonmodifieringar en bestämd fördelning runt DNase I-överkänslighetsstället [5] .
Högeffektiva metoder gör det möjligt att jämföra fördelningen av öppna kromatinregioner i olika vävnader eller cellkulturer från samma organism. En sådan jämförelse avslöjar en signifikant skillnad i fördelningen av sådana regioner i genomet [5] . Detta indikerar olika aktivitet hos sådana ställen i olika vävnader. Således kan promotorn och förstärkaren av en gen vara lokaliserad i den öppna kromatinregionen i en vävnad och stängas av nukleosomer i en annan. Detta indikerar olika genuttryck i olika vävnader och är mest karakteristiskt för vävnadsspecifika gener . Omvänt kallas gener som finns i den öppna kromatinregionen i alla vävnader och cellinjer vanligtvis som hushållsgener . Profilen för DNas-känslighet kan också förändras under cellutveckling och differentiering. För att identifiera aktiviteten hos vävnadsspecifika gener, använd definitionen av genontologi ( eng. Gene Ontology (GO) ) efter att ha utfört DNase-seq [5] .