Southern blot

Den aktuella versionen av sidan har ännu inte granskats av erfarna bidragsgivare och kan skilja sig väsentligt från versionen som granskades den 22 februari 2022; verifiering kräver 1 redigering .

Southern blot [1] , Southern blot [2] , Southern blot [2] , Southern blot [3] , Southern blot [3] , Southern blot [4] , Southern blot [3] (från engelska.  Southern blot ) är en metod som används inom molekylärbiologi för att identifiera en specifik DNA-sekvens i ett prov. Den består i att överföra DNA-fragmenten separerade genom elektrofores i agarosgel till ett membranfilter och sedan detektera i dem en känd sekvens från en DNA-sond med hjälp avhybridisering med den. Metoden är uppkallad efter uppfinnaren, engelske biologen Edwin Southern [5] .

Andra blötöverföringsteknologier, såsom Western blot , Northern blot , Southwestern blot , använder liknande metoder men för att detektera RNA eller protein i ett prov och är uppkallade efter metoden som myntats av Southern.

Metod

  1. Restriktionsendonukleaser ( restriktionsenzymer ) för att skära högmolekylärt DNA i mindre fragment.
  2. DNA-fragmenten utsätts för agarosgelelektrofores för längdseparation.
  3. Om det finns DNA-fragment längre än 15 kb . , behandlas gelén med till exempel saltsyra före överföring . Detta gör att DNA-fragmenten depurineras och bryter ner dem i mindre bitar, vilket underlättar efterföljande överföring till membranet.
  4. I det fall där den alkaliska överföringsmetoden används, placeras agarosgelen i en alkalisk lösning, som denaturerar DNA-dubbelhelixen och underlättar bindningen av det negativt laddade DNA:t till det positivt laddade membranet för ytterligare hybridisering. Samtidigt förstörs också RNA- rester .
  5. Ett ark av nitrocellulosa (eller nylon ) membran placeras ovanför eller under agarosgelen. Trycket appliceras direkt på gelén eller genom flera lager papper. För framgångsrik överföring krävs tät kontakt mellan gelén och membranet. Bufferten överförs av kapillärkrafter från ett område med hög fuktpotential till ett område med låg fuktpotential (membran). I detta fall överförs DNA från gelén till membranet. Polyanjoniskt DNA binder till ett positivt laddat membran genom krafterna från jonbytesinteraktioner.
  6. För den slutliga fixeringen av DNA på membranet värms det senare i en konventionell ugn eller vakuumugn till en temperatur av 80 °C under två timmar eller belyses med ultraviolett strålning (när det gäller nylonmembran).
  7. Utför hybridisering av en radioaktivt eller fluorescensmärkt DNA-sond med en förutbestämd DNA-sekvens med ett membran.
  8. Efter hybridisering tvättas överskottet av DNA-proben bort från membranet och hybridiseringsmönstret visualiseras på röntgenfilm genom autoradiografi (i fallet med en radioaktiv sond) eller så bedöms färgningen av membranet (vid kromogen färgning) .

Resultat

Hybridisering av sonden med ett specifikt DNA-fragment på filtermembranet indikerar att detta fragment innehåller en DNA-sekvens som är komplementär till nukleotidsekvensen för sonden.

Applikation

Southern blotting, som utförs på genomiskt DNA behandlat med restriktionsendonukleaser , kan användas för att bestämma kopiantalet av gener i genomet. En sond som hybridiserar till endast ett enda DNA-fragment som inte har klippts med restriktionsenzymer producerar ett enda band på en Southern blöt, medan flera band på en blöt indikerar att sonden har hybridiserat till flera identiska sekvenser. Förändringar i hybridiseringsbetingelser (ökning av temperaturen vid vilken hybridisering utförs, förändring av saltkoncentrationen) leder till en ökning i specificitet och en minskning av hybridisering med liknande men inte identiska sekvenser.

Anteckningar

  1. ↑ Hare R. G. , Butvilovsky V. E. , Davydov V. V. , Rachkovskaya I. V. . 7.2.2 Analys av DNA-fragment  // Medicinsk biologi och allmän genetik: lärobok. — 2:a uppl., rättad. - Minsk: Högre skola, 2012. - S. 100. - 496 sid. - ISBN 978-985-06-2182-5 .
  2. ↑ 1 2 Arefiev V. A. , Lisovenko L. A. . Southern-blotting, Southern-transfer  // Engelsk-ryska förklarande ordbok över genetiska termer / vetenskaplig. ed. L. I. Patrushev. - M. , 1995. - ISBN 5-85382-132-6 .
  3. ↑ 1 2 3 blot av Suzern  // Big Encyclopedic Dictionary of Medical Terms / ed. prof. E. G. Ulumbekova . - M.  : GEOTAR-Media, 2012. - S. 220. - 2263 sid. - 2000 exemplar.  — ISBN 978-5-9704-2010-2 .
  4. ↑ Blot: western, northern och southern blot (blot, western, northern, southern) // Epidemiological Dictionary / ed. JM Last för International Epidemiological Association; resp. ed. rysk utg. V.V. Vlasov . - 4:e uppl. - M.  : OIZ, 2009. - S. 28, 272. - 316 sid.
  5. ↑ Southern, E. M. Detektion av specifika sekvenser bland DNA-fragment separerade genom gelelektrofores // J Mol Biol.. - 1975. - doi : 10.1016 /S0022-2836(75)80083-0

Se även