Tvåhybridanalys är en molekylärbiologisk metod som tillåter högprecisionsdetektion av protein-protein- och DNA-protein-interaktioner under in vivo-förhållanden .
Den är baserad på användningen av transkriptionsfaktorer som består av fysiskt och funktionellt separerbara domäner : DNA-bindande ( bindande domän, BD ) och aktivatordomän ( aktiveringsdomän, AD ). Den fysiska interaktionen mellan två rekombinanta proteiner initierar fusionen av transkriptionsdomänerna "tvärbundna" med dem, vilket aktiverar uttrycket av reportergener .
För första gången beskrevs och tillämpades metoden för tvåhybridanalys av S. Fields och O. Song 1989 [1] när de studerade GAL4- transkriptionsfaktorn i jästen Saccharomyces cerevisiae . Men sedan dess har principen att detektera protein-protein-interaktioner med hjälp av GAL4 - transkriptionsaktivatorn anpassats för att skapa andra alternativa metoder, inklusive några som kan detektera DNA-protein- och DNA-DNA-interaktioner, såväl som multiproteinkomplex.
Förutom jäst används dessutom Escherichia coli [2] och däggdjursceller .
Metoden för tvåhybridanalys är baserad på de strukturella egenskaperna hos GAL - genpromotorerna som kodar för proteinet galaktosidas . Promotorerna för dessa gener består av TATA-boxen , UAS-aktivatorsekvensen och Inr - initieringsmotivet. Uppkomsten av galaktos i cellen leder till konformationsförändringar i regulatoriska proteiner , vilket gör att Gal4p-proteinet kan börja agera som en aktivator på olika GAL-promotorer [3] .
Transkriptionsaktivatorn GAL4p är ett endogent uttryckt protein 881 a.a. långt, innehållande 2 domäner : DNA-bindande (1-147 a.a.) och aktivator (771-881 a.a.). I naturliga transkriptionsfaktorer är dessa domäner delar av en enda proteinkula, men de kan också syntetiseras separat, samtidigt som de behåller sina ursprungliga funktioner.
Som ett exempel beskriver vi enheten för den klassiska tvåhybridsystemmetoden som används för att detektera interaktioner mellan proteiner. För att testa närvaron av interaktion mellan protein A och protein B skapas rekombinanta molekyler , varav en är protein A fusionerat till den DNA-bindande domänen (A-CD), och den andra är protein B fusionerat till aktivatordomänen ( DÅLIG). I sammansättningen av chimära proteiner behåller domänerna sina funktioner. Separat kan inte varje rekombinant molekyl orsaka aktivering av transkription , men eftersom den ligger i närheten, möjligen på grund av interaktionen mellan proteinerna A och B, återskapas den ursprungliga funktionen av GAL4p-proteinet och reportergenen aktiveras [4 ] [5] .
Jäst två-hybrin screening använder ofta genetiskt modifierade jäststammar som saknar biosyntesen av vissa näringsämnen (vanligtvis aminosyror eller nukleinsyror ). Sådana stammar kallas auxotrofa . När den odlas på media som saknar dessa näringsämnen kommer jästen att dö. Därefter transfekteras två auxotrofa stammar med plasmider i vilka galaktosidaspromotorn reglerar transkriptionen av genen som kodar för det saknade metaboliska vägelementet . En plasmid kommer också att innehålla genen för protein A sammansmält med SD. I detta fall är protein A vanligtvis känt. Den andra plasmiden kommer att innehålla AD-fusion B-proteingenen. I det här fallet kan protein B antingen vara ett protein med en okänd funktion, möjligheten att binda till protein A måste kontrolleras, eller istället för en plasmid med B-AD- fusionsproteingenen kan det finnas ett helt bibliotek av olika plasmider som innehåller gener för olika proteiner fusionerade med AD. Således screenas proteinbiblioteket för möjligheten till interaktion med protein A. Metoder som använder biblioteket antar att endast ett par plasmider kommer in i cellen som studeras, så att varje cell inte producerar mer än ett protein från biblioteket. Sedan korsas två auxotrofa stammar [2] . I den resulterande hybriden , efter framgångsrik interaktion mellan A och B, blir AD- och SD-domäner indirekt länkade, och AD är i omedelbar närhet till transkriptionsstartstället för reportergenen. Den resulterande stammen kommer inte att vara auxotrof. I frånvaro av interaktion finns det ingen transkription, hybriden är auxotrofen. Därför är framgångsrik interaktion associerad med en förändring i den cellulära fenotypen .
Tvåhybridanalys kräver ingen speciell dyr utrustning och möjliggör analys av hela bibliotek. En betydande nackdel med denna metod är dock ett stort antal falskt positiva resultat .
Denna metod bygger på samma principer som tvåhybridsystemet, med skillnaden att protein A och B inte direkt interagerar med varandra. Mellan dem finns ett tredje grundämne-ämne X. Detta ämne kan vara en DNA- eller RNA- molekyl , en liten organisk ligand , en inhibitor som kovalent binder till enzymets aktiva centrum . Metoden gör det möjligt att identifiera NK -proteininteraktioner, enzymatisk aktivitet i förhållande till ett givet substrat , interaktionen av ett protein med små molekyler [4] .
Huvudskillnaden från det "direkta" tvåhybridsystemet här är att genen vars uttryck regleras av detta system är dödlig. Således, om det finns en interaktion mellan proteinerna A och B, kommer hybridorganismen att dö. Denna metod används för att bestämma de aminosyrarester som är nödvändiga för interaktionen mellan kulorna A och B [4] .
I denna modifiering av den klassiska metoden finns det bara en rekombinant molekyl, AD-A-B-SD. I detta fall infogas en känd DNA- sekvens före reportergenen , BD varierar. På så sätt går det att avgöra vilka proteiner som binder till en given DNA-sekvens [4] .
Det antas att vilken levande cell som helst kan användas för att implementera ett tvåhybridsystem, men det finns praktiska överväganden om den låga kostnaden och stabiliteten för den valda cellinjen [6] .
Historiskt sett är den första organismen för ett tvåhybridsystem jäst . Jäst är en stabil, enkel och välstuderad modellorganism . Jästceller håller neutrala pH -värden inuti cellen trots sura pH -värden i den yttre miljön. Jästsvampar är också svagt känsliga för extracellulära toxiner, de kan manipuleras utan att använda molekylära metoder [7] Det är viktigt att notera behovet av nukleära lokaliseringssignaler , eftersom hela den genetiska apparaten av jäst är lokaliserad i kärnan. I deras frånvaro kommer ett potentiellt interagerande proteinpar inte att översättas och kommer inte att interagera.
Bakteriesystem kan användas på samma sätt som jästsystem. De har uppenbarligen mer potential och är mer att föredra för att använda ett tvåhybridsystem. Bakteriesystem tillåter användning och analys av bibliotek större än 10 8 , har en snabbare tillväxthastighet och större potential för små molekyler permeabilitet. Det finns heller inget behov av nukleära lokaliseringssignaler , och det blir möjligt att studera proteiner som är giftiga för jäst. På grund av snabbare selektiva metoder säkerställs en låg falsk positiv frekvens (3·10 −8 ) [6] .
När man studerar proteiners interaktion är det möjligt att identifiera nya funktioner. Genom att använda ett känt A 0 - protein , ett bibliotek av okända B n - proteiner , och efterföljande jämförelse med ett tidigare känt par av A 0 B 0 - interagerande proteiner , kan man få information om likheten mellan B n och B 0 . Liknande data kan erhållas genom att studera interaktionerna av ett känt bibliotek av proteiner med ett enda protein med en okänd funktion [7] .
Tvåhybridsystemet används när det för ett par kända och interagerande proteiner är nödvändigt att bestämma aminosyraresterna som bildar området för deras interaktion. För att göra detta utförs mutationer i DNA-basparen motsvarande specifika aminosyror i de använda plasmiderna . Sålunda bildas ett bibliotek med punktförändringar i aminosyrarester, på basis av vilket det med hjälp av ett tvåhybridsystem är möjligt att bestämma betydelsen av en viss aminosyra vid bildandet av interaktion med ett partnerprotein [7 ] .
Moderna metoder gör det möjligt att konstruera en cell som valts för studier på ett sådant sätt att den speglar en eller annan molekylär aspekt som valts för studier. I sådana celler blir det möjligt att testa specificiteten och noggrannheten för läkemedelstillförseln medierad av tvåhybridsystemet, vilket gör att du snabbt kan lösa problemen med nya biverkningar.
Ett liknande tillvägagångssätt används för toxiner och gifter [7] .
För att söka efter zinkfingerproteiner (zinkfingerproteiner eller ZFPs) har metoder baserade på tvåhybridanalys framgångsrikt tillämpats [2] . Som ett DNA-bindande protein används ZFP för att skapa icke-standardiserade DNA-bindande domäner som koordinerar till en förutbestämd region av DNA-sekvensen.
Metoden är baserad på skapandet av ett ZFP- bibliotek genom att slumpmässigt ändra vissa aminosyrarester. Vidare väljs de som kan interagera med målplatsen som ingår i UAS från dem, motsvarande de erforderliga egenskaperna. Varje ZFP känner dock bara igen en liten DNA-sträcka, cirka 3-4 baser, så ett komplex bestående av två ZFP med en konstant sekvens används för att förbättra bindningsnoggrannheten och förhindra igenkänning av platser utanför UAS . ZFP från ett sådant komplex binder vid kanterna av målområdet och förhindrar bindning utanför UAS [2] .
Ett antal andra DNA-bindande domäner kan också undersökas med detta system.