Metoden för lokal potentialfixering , patch-clamp ( eng. patch - fragment, clamp here - fixation) är en elektrofysiologisk teknik för att studera egenskaperna hos jonkanaler , bestående av det faktum att ett fragment av cellmembranet isoleras med hjälp av en speciell mikropipett. Denna teknik gör det möjligt för försöksledaren att kontrollera potentialskillnaden mellan membranets sidor, samt placera den i en miljö med en viss kemisk sammansättning. Under dessa välkontrollerade förhållanden mäts jonströmmarna som passerar genom membranet, vilket i slutändan leder till slutsatser om hur jonkanaler reagerar på elektrisk och kemisk stimulering. Metoden är så känslig att den gör att man kan observera beteendet och kemiska omvandlingar hos enskilda molekyler som interagerar med membranet. [1] Experimentella protokoll har utvecklats för att mäta egenskaperna hos jonkanaler på ett optimalt sätt. De tyska forskarna Erwin Neher och Bert Sakmann , som utvecklade denna teknik, fick Nobelpriset 1991.
Levande celler är täckta med ett membran , vars strukturella bas är ett dubbelt lager av lipider , något permeabelt för vatten och praktiskt taget ogenomträngligt för joner. Varje cell måste byta med den yttre miljön olika ämnen och i synnerhet joner. Transporten av joner över membranet spelar en viktig roll i processerna för cellexcitation och signalöverföring. Joner kommer in i cellen och lämnar den genom proteinstrukturer inbyggda i membranet - kanaler och transportörer [2]
Transportörer är membranproteiner som binder till ett transporterat ämne på ena sidan av membranet, bär detta ämne över membranet och sedan frigör det. En sådan överföring blir möjlig eftersom transportören, som ett resultat av samband med ett ämne, ändrar konformation (det vill säga form, orientering). Den viktigaste transportören i eukaryota celler är natrium-kaliumpumpen . För att denna pump ska fungera krävs energi som den hämtar från ATP som lagras i cellen . Under en cykel av dess drift tar pumpen bort 3 Na + -joner från cellen och introducerar 2 K + -joner i den . En molekyl av denna transportör gör cirka 10³ cykler per sekund. En liknande frekvens av cykler är typisk för andra typer av transportörer [3] .
Kanaler är proteiner som fungerar som membranporer, eftersom de bildar öppningar genom vilka joner kan passera. Membrankanaler är selektiva - genomsläppliga endast för vissa ämnen. Selektivitet beror på porradien och fördelningen av laddade funktionella grupper i dem. Det finns kanaler som selektivt passerar natriumjoner (natriumkanaler), såväl som kalium-, kalcium- och kloridkanaler. För varje typ av jon finns det inte en, utan ganska många typer av kanaler [4] . 10 6 - 10 7 joner passerar en kanal per sekund [3] .
Trots grundläggande skillnader i transportmekanismen genom kanaler och transportörer kan de bildas av mycket homologa proteiner. Så, nyligen mottagna data om att mutationen av en enda aminosyra i proteinet från den tvåvärda metalltransportören DMT1 leder till dess omvandling till en kalciumkanal . Dessutom finns det minst en transportör (en erytrocytklorid-bikarbonatväxlare) som utför 10 5 överföringar per sekund [3] , vilket är mycket nära de hastigheter som är karakteristiska för kanalerna, och antyder att det finns någon "mellan" mellan kanalerna och mekanismtransportörerna.
Eftersom joner är elektriskt laddade molekyler, när de passerar genom membrankanalerna, överförs även laddningen, vilket gör att en elektrisk ström flyter genom membranet. Denna ström kan mätas. Ju större potentialskillnaden mellan membranets sidor desto större ström. Konduktiviteten (förhållandet mellan ström och potentialskillnad) för en enskild kanal i öppet tillstånd varierar beroende på typen av kanal, från 4–5 (i CFTR [5] och ENaC [6] ) till 30–50 (till exempel i en nikotinkänslig kolinerg receptor [7] ) picosiemens . Det betyder att med en potentialskillnad på 100 mV kommer en ström på flera pikoampere att flyta genom kanalen.
Elektriska fenomen på cellmembran kan mätas med hjälp av vassa glasmikroelektroder som sätts in i cellen. Tekniken med en intracellulär elektrod gör det möjligt att mäta potentialskillnaden vid en fast ström. Mindre vanligt kan denna teknik mäta strömmen vid en fast potential med hjälp av switching clamp-tekniken. Alla mätningar sker uteslutande på hela cellen och studerar därmed de elektriska egenskaperna hos hela cellmembranet.
Det faktum att fixeringen av transmembranpotentialen kommer att göra det möjligt att mäta membranets konduktivitet från förändringar i ström vid konstant spänning upptäcktes först på 1940-talet. XX-talet, och snart började de engelska forskarna Alan Hodgkin och Andrew Huxley ( Alan Hodgkin och Andrew Huxley ) experiment med två-elektrods potentialklämma (2-elektrods spänningsklämma). [8] Kärnan i metoden är följande. Två elektroder sätts in i cellen, en till - referenselektroden - förblir utanför cellen. Den första intracellulära elektroden tjänar till att mäta den transmembrana potentialskillnaden (det vill säga potentialskillnaden mellan den och referenselektroden), den andra kan leverera ström. Det är inte möjligt att använda samma vassa elektrod för strömtillförsel och potentialskillnadsmätning. Faktum är att en sådan elektrod har en ingångsresistans i storleksordningen 100-200 MΩ, vilket är jämförbart med resistansen hos cellmembranet, därför, om ström flyter genom "elektrodcell"-systemet, då spänningsfallet på elektroden kommer att stå i proportion till spänningsfallet på själva membranet , och det finns inget sätt att separera dessa två delar [8] . Vidare ställer en speciell anordning - en signalgenerator - kommandopotentialen , som ska vara lika med transmembranpotentialen. Den uppmätta transmembranpotentialen matas till ingången på jämförelseanordningen , som subtraherar den uppmätta potentialen från kommandot ett och, beroende på storleken på skillnaden, tillför ström till strömelektroden på ett sådant sätt att den kompenserar för denna skillnad. Strömvakten mäter i sin tur hela tiden mängden ström som krävs för detta. På 1940- och 50-talen, när Hodgkin och Huxley arbetade, fanns det inga mikroelektroder, så tunna trådar användes som intracellulära elektroder. Detta avgjorde valet av objektet - ett jättelikt bläckfiskaxon med en diameter på 1 mm, i vilket dessa trådar sattes in. På detta objekt, med hjälp av metoden för två-elektrodepotentialfixering, utförde forskare experiment där aktionspotentialens joniska karaktär fastställdes och förekomsten av jonkanaler först postulerades (Nobelpriset 1963 , delat med J. Eccles , som mottog den för forskning inom området synaptisk överföring). Tvåelektrodpotentialklämning används fortfarande idag, med vassa glasmikroelektroder, men även med dem har denna teknik betydande begränsningar: två elektroder kan bara sättas in i en mycket stor cell (till exempel en grodaoocyt).
I slutet av sjuttiotalet av XX-talet. Erwin Neher (E.Neher) och Bert Sakman (B.Sakmann) fann att konformade glaspipetter med en spetsdiameter på 1-2 mikron kan bilda kontakter med cellmembranet (membran-glasgränsen) med ett motstånd på flera gigaohm - detta är en så kallad gigaohm-kontakt . Det låter dig isolera från den yttre miljön och från resten av membranet det fragment som finns inuti pipetten. Det fragment av membranet som avgränsas av pipetten kallas patch - "fragment", ordet klämma (fixering) i metodens namn kan tolkas både som infångning och isolering av detta fragment, och som fixering av transmembranpotentialen i en isolerat fragment, eller, som kommer att beskrivas senare, potential eller ström på hela cellen. [9] En silver-klorelektrod placeras i en pipett fylld med en elektrolytlösning, den andra elektroden placeras extracellulärt, i tvättvätskan. Den elektriska kretsen skiljer sig från den som tidigare beskrivits för fixering av två elektroder genom att samma elektrod används både för att mäta potentialskillnaden och för att applicera ström, vilket är möjligt på grund av pipettens relativt låga resistans.
Bild 1 visar en del av en sådan uppställning.
En enorm sfär, varav en del är synlig på monitorn i mitten av fotot, är en cell (en oocyt av grodan Xenopus laevis ), som för närvarande är på mikroskopstadiet, en patchpipett är ansluten till den, dess diameter vid nosen är ca 3 mikron. Efter att ha upprättat en gigaohm-kontakt isolerar den ett fragment av membranet med en yta på cirka 7 μm², strömmen från jonkanalerna i detta fragment kan registreras.
Den just beskrivna konfigurationen kallas cell-attached patch-clamp (patch-clamp). Det illustreras i figur 2.
Denna konfiguration har emellertid två nackdelar.
För det första tillåter den inte mätning med tillräcklig tillförlitlighet, och följaktligen inställning av transmembranpotentialskillnaden, eftersom båda elektroderna, både pipett och extern, är på samma sida av membranet. Generellt sett är det möjligt att använda en tvättlösning med en jonisk sammansättning som efterliknar cytoplasmans sammansättning , att depolarisera membranet utanför pipetten, så att potentialskillnaden mellan den externa elektroden och cytoplasman försvinner, och sedan potentialskillnaden. mellan elektroderna kommer att vara lika med transmembranpotentialen - men allt detta är mycket ungefärligt, eftersom den exakta sammansättningen av cytoplasman är okänd för oss.
För det andra tillåter denna konfiguration inte att kontrollera sammansättningen av mediet utanför pipetten - cytoplasman förblir där, vars sammansättning inte är helt bestämd.
Men i viss mån är denna egenskap hos den cellanslutna konfigurationen också en fördel: denna konfiguration låter dig arbeta under förhållanden som ligger närmast fysiologiska.
Men om pipetten tas bort från cellen med en snabb rörelse, kommer den "inre" delen av membranet att lossna från cellen och en inifrån och ut-konfiguration kommer att erhållas (utsidan inuti), så kallad eftersom den inre sidan av membranet, vanligtvis vänd mot cytoplasman, kommer att vara utanför - i tvättlösningen, och den yttre är inuti pipetten. (Schema 3.) En alternativ metod för övergång till konfigurationen inifrån och ut är följande: från den cellfästa konfigurationen dras pipetten ut smidigt och bildar en sluten vesikel på båda sidor; lyft sedan upp pipetten i luften och sänk ner den i det andra badet, med intracellulär lösning. Under överföringen förstörs vesikelns yttre membran, vilket resulterar i bildandet av en inifrån-ut-konfiguration.
Nu är potentialskillnaden över membranfragmentet strikt lika med potentialskillnaden mellan elektroderna. Uppenbarligen, när man använder denna modifiering, fylls pipetten med en lösning som efterliknar den extracellulära miljön, medan tvättlösningen görs nära cytoplasmans sammansättning . Samtidigt, genom att ändra sammansättningen av tvättlösningen, är det möjligt att studera hur sådana förändringar i cytoplasman påverkar strömmen av de kanaler som är intressanta för oss - trots allt kommer tvättlösningen i kontakt med den cytoplasmatiska sidan av membranet) . Samtidigt vet vi exakt både sammansättningen av vätskan på båda sidor av membranet och potentialskillnaden, vilket gör att vi kan exakt karakterisera kanalerna med hjälp av de biofysiska ekvationerna av Nernst och Goldman-Hodgkin-Katz. Samtidigt, om en kanal kom in i en isolerad del av membranet, observerar vi beteendet hos en enskild molekyl och, om det är en ligandreglerad kanalreceptor , då dess interaktion med andra enstaka molekyler.
Om det, enligt experimentets förhållanden, är nödvändigt att ändra sammansättningen av det extracellulära mediet , kan hela cellkonfigurationen användas . I det här fallet dras pipetten inte tillbaka från cellen, men undertryck appliceras på den, och därmed förstörs det isolerade fragmentet av membranet.
Därefter kopplas pipetten till den intracellulära miljön; eftersom cellen vanligtvis är liten, på grund av diffusion visar sig sammansättningen av cytoplasman snart vara identisk med sammansättningen av pipettlösningen, därför känner vi, liksom i föregående fall, både sammansättningen av vätskorna och möjlig skillnad. Observera att om pipettelektroden var "extracellulär" och den interna elektroden var "intracellulär" i konfigurationen inifrån och ut, har de nu omvänt sina roller. Ur synvinkeln att studera ström genom kanaler är fördelen med denna metod att cellulära strukturer och regleringsmekanismer bevaras här. Det är sant att ämnen med låg molekylvikt kan diffundera från cytoplasman in i pipetten och vice versa, så att det fullständiga bevarandet av de reglerande mekanismerna i denna konfiguration inte kan uppnås. En viss nackdel med konfigurationen kan anses vara att den totala strömmen för alla kanaler i cellen mäts, och inte strömmarna genom enstaka kanaler, det vill säga upplösningen för denna metod är lägre än den för konfigurationer med ett rivet membran.
För att lösa problemet med den reducerade upplösningen av metoden tillåter utsidan-ut- konfigurationen (utsidan utsidan). Om pipetten långsamt tas bort från cellen efter att ha bytt till helcellsläge, lossnar inte membranet omedelbart utan börjar sträcka sig in i röret - detta kan ses på bild 5.
Observera att bitar av cytoplasma är tydligt synliga i pipetten , som kom dit efter förstörelsen av membranet under övergången till helcellen.
Nästa fas av processen visas på bild 6.
Membranröret har blivit mycket tunt och nästan osynligt (" prominens " på cellytan är en liten del av cytoplasman som finns kvar i membranröret). I nästa ögonblick kommer röret att gå sönder, och membranet kommer att stänga på pipetten i en "inverterad" form - vi kommer att befinna oss i en "utifrån-ut" -konfiguration
Så, pipetten och dess elektrod, som helcellskonfigurationen, är intracellulära, vi ändrar fritt sammansättningen av den extracellulära lösningen, arean av membranet som studeras är liten, så vi kan återigen studera enstaka kanaler.
Perforerad patch är en specifik variant av patch-clamp i helcellsläge. I det här fallet innehåller pipettlösningen en liten mängd av ett speciellt antibiotikum , till exempel amfotericin-B eller gramicidin . Antibiotika av denna klass bildar jonkanaler i cellmembranet på platsen som är fäst vid mikropipetten.
Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att undvika att ersätta cellens inre miljö med en lösning från en pipettelektrod, det vill säga att cellen förblir vid liv med så liten skada som möjligt. Således är cellens svar på stimuli så nära naturliga som möjligt. Samtidigt har denna metod ett antal nackdelar. För det första, jämfört med det klassiska helcellsläget, är den elektriska ingångsresistansen (som huvudsakligen består av pipettens resistans och resistansen vid förbindelsen mellan pipetten och membranet) betydligt högre. Detta sänker kvaliteten på potentialklämningen, ökar brusnivån under inspelningen och ökar värdena för alla fel som är förknippade med förändringar i motståndet i hela kretsen (från elektroden i den externa lösningen till elektroden i pipetten). För det andra tar det ganska lång tid (upp till 30 minuter) för antibiotikan att fungera, vilket avsevärt minskar experimentets användbarhetstid. Och för det tredje skadar antibiotikan också membranet vid förbindelsen med pipettspetsen, vilket leder till accelererad förstörelse av gigaohmkontakten och dessutom minskar den effektiva experimentella tiden. Således kan denna version av metoden framgångsrikt användas endast i experiment som inte kräver lång tid för att studera de fenomen som studeras.
En intressant variant av patch-clamp är den kärnförsedda patchen. (Fixering av potentialen med cellkärnan [11] ).
Metoden är följande. Pipetten förs till cellen och bryter sedan ryckigt genom membranet. Efter det förs pipettens spets till cellkärnan, ett lätt undertryck appliceras på pipetten. Som ett resultat fastnar pipetten till kärnan. Sedan dras pipetten med kärnan i änden smidigt tillbaka och tas bort från buren. Pipetten måste tas ut ur cellen på ett sådant sätt att sektionen av membranet vid utgångspunkten "sätter på" den fästa kärnan och bryts av, lindar runt den. Resultatet är en specifik version av det yttre plåstret, där en mycket större del av membranet än i den vanliga versionen av metoden är fäst vid änden av pipetten, lindad runt cellkärnan.
När man studerar förändringar i konduktansen för kanaler av samma typ som svar på någon kemisk verkan eller beroendet av deras konduktans på potentialskillnaden över membranet, är det bekvämt att fixera potentialen och mäta kanalströmmen, som vi har beskrivit än så länge. Denna, den vanligaste typen av patch-clamp, kallas en spänningsklämma. Men ibland är en forskare intresserad av processerna för transmembranjontransport som är förknippad med en förändring i membranpotentialen - till exempel ledning av en nervimpuls. I sådana fall kan du göra tvärtom: fixa strömmen på en konstant nivå och studera förändringarna i potentialskillnaden i det här fallet. Detta alternativ kallas strömtång (strömfixering).
Registrering av en enda kanal av glycinreceptorn . Två tillstånd är tydligt synliga: stängt (det motsvarar noll ström) och öppet (det motsvarar en ström på cirka 7 pikoampere). Kanalen övergår spontant från ett tillstånd till ett annat då och då, det finns inga mellanliggande tillstånd. Inspelning låter dig få två av kanalens viktigaste egenskaper: konduktivitet (baserat på värdena för transmembranpotentialen och strömmen) och sannolikheten att vara i öppet tillstånd (definierat som förhållandet mellan den tid då kanalen är öppen för den tid då strömmen registreras). Förresten, oftast regleras kanalens aktivitet fysiologiskt genom att ändra denna sannolikhet.
Inträde i helcellskonfigurationen. Samlande kanal epitelcell. Transmembranpotential −60 mV. Med intervaller på 1 minut i 30 sekunder injiceras amilorid, en hämmare av den epiteliala natriumkanalen, i tvättlösningen (tidpunkten för administrering visas med mörka rektanglar). Förresten, känslighet för inhibitorer är en annan av kanalens viktigaste egenskaper. Införandet av amilorid leder varje gång till en minskning av strömmen till noll, vilket innebär att nästan all konduktivitet vid -60 mV i denna cell är konduktiviteten hos den epiteliala natriumkanalen . Till skillnad från den tidigare inspelningen tycks de aktuella förändringarna vara kontinuerliga - detta beror på att många kanaler spelas in samtidigt (ca 2000) respektive, det finns cirka 2000 nuvarande nivåer - från "alla öppna" till "allt stängt".
Detta är en teknik utvecklad för att öka produktiviteten inom elektrofysiologi när bulkmätningar av transmembrankonduktans krävs. I synnerhet finner denna metod tillämpning inom farmakologisk forskning. Om med en klassisk patch-clamp pipetten placeras på en stationär cell, då med en plan, tvärtom, appliceras cellsuspensionen på ett mikrochip med ordnade hål med subcellulär diameter. Cellen lägger sig på hålet, suger till det med hjälp av en pump, som ett resultat av vilket en gigaohm-kontakt bildas. Vidare utförs studien enligt samma princip som i den traditionella patch-clamp. [12] [13]
Den största fördelen med den plana patch-clamp är att experimentet är mycket enklare, kräver mindre skicklighet från forskaren och tar mindre tid. En hel del mätningar kan utföras automatiskt efter varandra. Enligt författarna till tekniken gör denna metod det lättare att perfusera det intracellulära innehållet, samt mer exakt dosera de studerade eller testa farmakologiska substanserna. Med denna metod är det relativt enkelt att arbeta med celler som vanligtvis är i suspension – i synnerhet med blodkroppar.
Den plana patch-clamp-metoden har emellertid ett antal betydande begränsningar. Huvudsaken är att de studerade cellerna måste vara i suspension. Följaktligen är det inte möjligt att arbeta med vävnadsfragment, det är omöjligt att studera interaktionen av celler med varandra. För att mobilisera celler är det nödvändigt att använda proteasenzymer som kan modifiera beteendet hos de studerade jonkanalerna.
Allt ovanstående leder till det faktum att den plana patch-clamp finner tillämpning främst i farmakologiska screeningstudier där massmätningar krävs, men är inte så vanlig inom området grundläggande vetenskap.