Ana-telofasmetod för analys av kromosomavvikelser

En antilofasanalys  är ett genetiskt test baserat på visuell registrering av kromosomavvikelser (kromosomskada) vid anafas- och telofasstadierna i den mitotiska cellcykeln . Anatelofasanalys är en enkel, ekonomisk metod som inte kräver kunskap om karyotyp och identifiering av kromosomer. Det låter dig bara identifiera vissa typer av kromosomavvikelser , men dess känslighet är ganska tillräcklig för att komma fram till en " mutagen " eller " icke-mutagen " faktor. Anatelofasanalys är ganska känslig, korrekt och bekväm i det första skedet av ekotoxikogenetisk forskning [1] .

Historik

Utsläpp av genotoxiska ämnen i miljön som ett resultat av mänskliga aktiviteter kräver lämpliga genetiska tester för att bedöma den potentiella påverkan av dessa faktorer på ekosystemen. Anatelofasanalys har beskrivits som ett snabbt och ekonomiskt genetiskt test. Bland de tidigaste studierna där denna analys tillämpades bör experiment på lök noteras ( A. Levan ). Hittills har den använts som den huvudsakliga metoden för genetisk analys för testsystemet Alliums testväxt , som studerar effekten av olika genotoxiska ämnen på rotmeristemceller [2] [3] [4] .

Känslighet och tillämpbarhet

Ana-telofasanalys är mycket känslig för tester i mycket olika riktningar. Oavsett om det är prover av substrat från miljön ( vatten , jord , bottensediment ) eller ämnen av antropogent ursprung, samt strålning av olika spektra (både joniserande och icke-joniserande). Dessutom är fördelen med denna analys dess mångsidighet (den är tillämplig i nästan alla fall när mitos inträffar ) och enkel beredning av preparat, vilket är mycket viktigt när man arbetar med djurceller [ 5] . Antelofasanalys av kromosomavvikelser i lök ( Allium cepa ) celler rekommenderas som ett verktyg för miljöcytomonitorering. Genom att mäta genotoxicitet bidrar den till bedömningen av graden av miljörisk från hushålls- och industriprodukter, som ständigt introduceras och blir allt viktigare i vardagen [2] [6] .

Analysteknik

Inkluderar analys under mikroskop av ett preparat av celler fixerade och färgade i proliferationsstadiet . Det finns ett antal varianter av antilofasanalys. Således, enligt den ursprungliga versionen av analysen som beskrivs av Fiskesjo ( 1985 ), räknas de första 100 anafas- och telofascellerna på preparatet, av vilka avvikande celler noteras . Senare började en annan version av I. M. Prokhorov et al användas. (2003), som tar hänsyn till alla anafaser och telofaser på preparatet, bland vilka avvikande är noterade . Inte särskilt tidiga anafaser och tidiga telofaser är lämpliga för att ta hänsyn till kromosomavvikelser . Eftersom en delande cell inte alltid sprider sig på preparatet längs den längsgående axeln för delningen, när man väljer celler lämpade för att räkna kromosomavvikelser, måste man ta hänsyn till avståndet mellan dotterkärnorna  - det får inte vara mindre än storleken på en av dem [1] [2] [6 ] .

Typer av analyserade aberrationer

Vid anafas- och telofasstadierna beräknas två kategorier av aberrationer, klassiska för denna analys, vilka är kromosomalt material som släpar efter polerna (acentriska fragment och ringar, eftersläpande kromosomer) och broar. Alla är ganska tydligt synliga visuellt och urskiljbara. Mycket ofta, fördröjningar och överskridanden som indikerar förändringar i akromatinspindeln ingår och räknas i en separat kategori.

1. Acentriska fragment och ringar kan vara enkla eller parade. De är placerade mellan barnstjärnor eller borta från dem. Huvuduppgiften är att känna igen singelskap eller parning och att skilja dem från eftersläpande kromosomer. Enstaka fragment är fragment av kromatidursprung. Förlusten av ett fragment från ett par (av kromosomalt ursprung) är uppenbarligen ett sällsynt fenomen, eftersom attraktionen mellan systerkromatider bevaras även i anafasstadiet. Av samma anledning är det osannolikt att ett enda fragment kan uppstå på grund av sammansmältningen av systerkromatiderna i det parade fragmentet och deras utveckling längs längden.
2. Parade fragment är fragment av isokromatid eller kromosomalt ursprung. Vi kan prata om anslutningen av de skadade ändarna av systerkromatider, och inte om den eftersläpande kromosomen, bara om det parade fragmentet har ett bågformigt utseende. Det bör noteras att bedömningen av denna funktion är extremt svår och därför inte kan utföras i alla fall.
3. Broar delas ibland in i kromosomala och kromatida broar. En kromosombrygga förstås som en dicentrisk kromosom: den består av två kromatider, oftast korsade. Kromatidbryggan är en dicentrisk kromatid, så den ses som en enda kromatid. Genom "tjockleken" på bron kan man inte bedöma dess kromosomala eller kromatida karaktär. Det är inte alltid möjligt att särskilja bryggans natur, och därför är det knappast tillrådligt att utföra en sådan separation med den totala kromosomfärgningsmetoden, som inte tillåter identifiering av individuella kromatider.
4. Släpande kromosomer eller kromatider är oftast lätt att känna igen, eftersom de kan ses som en centromer eller strukturell heterogenitet, vilket inte är typiskt för fragment. De största svårigheterna uppstår när det är nödvändigt att skilja den eftersläpande metacentriska kromatiden från den akrocentriska kromosomen. Samtidigt är svaret på denna fråga viktigt, för som ett resultat av att släpa efter kromosomen bildas två hypoploida celler, och som ett resultat av att släpa efter kromatiden, en hypoploid och en normal cell.

Det kan inte finnas någon absolut standard för att redovisa avvikelser och för att presentera erhållna resultat. I praktiken finns det kombinationer av olika typer av aberrationer i samma cell. Teoretiskt kan vilken kombination av avvikelser som helst förväntas. Grunden för detta är asynkroniteten i redupliceringen av ärftligt material. Utöver vägen kan även andra, mindre vanliga typer av aberrationer, såsom multipolära mitoser och polyploidi, registreras [6] .

Mutationshastighetsberäkning

Beteckning	Karakteristisk	Beräkning
XA+abs.	XA+abs., %  — frekvens av kromosomavvikelser och eftersläpningar Frekvensen av kromosomavvikelser och eftersläpningar  beräknas som förhållandet mellan summan av ana- och telofasceller där kränkningar registrerades och det totala antalet analyserade ana-telefaser.	, där XA+ots.  är summan av avvikande celler i ana- och telofasstadierna , och N(A+T)  är det totala antalet analyserade anafaser och telofaser på preparatet.

Transformation

Frekvensen av kromosomavvikelser och eftersläpningar kan representeras som svårighetsgraden av den mutagena effekten, enligt systemet för integrerad bedömning av den mutagena effekten.

Rekommendationer för att utföra en antilofasanalys

För de flesta studier kan följande rekommenderas:

1. En viktig förutsättning för att bedöma typerna (spektrum och frekvens av kromosomavvikelser) är att ta hänsyn till dem vid den första celldelningen efter mutagenets verkan. Detta beror på det faktum att en betydande del av avvikelser och avvikande celler elimineras efter den första delningen eller får en annan form, även om vissa kromosomavvikelser, som observeras i form av broar, kan kvarstå i 12-15 mitotiska cykler.
2. Analysera inte omarrangemang när celler är överlagrade och när integriteten hos deras membran kränks.
3. Ta hänsyn till alla typer av morfologiska förändringar, som kan tas med i beräkningen med denna teknik.
4. Analysera förändringar cell för cell, det vill säga registrera i experimentprotokollet kompatibiliteten av avvikelser som förekommer i varje cell.
5. Celler där det inte är möjligt att bestämma typen av avvikelser bör hänföras till klassen av celler med osorterade aberrationer; räkna dem endast i beräkningen av det totala antalet avvikande celler.
6. Var extremt försiktig när du kombinerar data av något slag (till exempel data från enstaka replikat och data från liknande experiment, från punktfragment och ringar, från dicentriker och medföljande acentriker, etc.). Om giltigheten av någon förening bevisas för något objekt eller villkor, måste det för andra objekt och villkor kontrolleras särskilt.
7. När data presenteras i en artikel är det nödvändigt att ange antalet individer som undersökts (eller upprepningar av experimentet), antalet analyserade celler, antalet av var och en av de typer av avvikelser som beaktas, typerna av avvikande celler och deras frekvens och antalet aneuploida celler.

För en exakt bestämning är det nödvändigt att känna till strukturen av karyotypen för den studerade växt- eller djurarten i normen [6] .

Metoder och objekt baserade på denna metod

• Allium test
• Vicia test

Se även

• Metafasanalys
  • Allium test
• Mitotiskt index
• Kromosomförändringar

Anteckningar

1. ↑ 1 2 Prokhorova I. M., Fomicheva P. N., Kovaleva M. I. Utvärdering av mitotoxiska och mutagena effekter av miljöfaktorer // YarSU: Riktlinjer. - Yaroslavl: YarGU, 2003. - S. 23.26 .
2. ↑ 1 2 3 Jet Rank. Metoden för Allium anafas-telofas kromosomavvikelseanalys // Ekologija. - Vilnius, 2003. - T. 1 . - S. 38-42 .
3. ↑ Levan Albert. EFFEKTEN AV KOLCHICIN PÅ ROTMITOSER I ALLIUM // Hereditas. - 1938. - T. 24 , nr. 4 . — S. 471-486 .
4. ↑ Fiskesjo G. Alliumtestet som standard inom miljöövervakning  // Hereditas. - 1985. - T. 102 . - S. 99-112 .
5. ↑ W. Venegas, C. Lasne, R. Lowy, J.-P. Buisson och I. Chouroulinkov. Naftofuraner inducerade kromosomavvikelser detekterade i metafas, anafas och telofas V79 kinesiska hamsterceller // Mutationsforskning/Genetisk toxikologi. - Elsevier BV, 1985. - S. 53-62 .
6. ↑ 1 2 3 4 Kalaev V.N., Karpova S.S. Cytogenetisk övervakning: metoder för att bedöma miljöföroreningar och tillståndet hos organismens genetiska apparatur. - VSU, 2004. - 80 sid.

Länkar

• Song D.S., Romanovsky A.V. Mitos i en växtcell: norm och patologi  : Vetenskaplig och praktisk vägledning. - Moskva: JRE - IRE dem. V.A. Kotelnikov RAS, 2010. - P. 929 .