Secretomics är en del av proteomics som studerar alla utsöndrade proteiner i en cell , vävnad eller organism [1] . Utsöndrade proteiner är inte bara involverade i många olika fysiologiska processer, inklusive cellulär signaltransduktion och extracellulär matrix ommodellering , utan är också en integrerad del av invasionen och metastasen av maligna celler [2] . Sekretomik är därför viktig för att identifiera cancerbiomarkörer .
År 2000 myntade Tjalsma m fl begreppet secreto i sitt arbete om bakterien Bacillus subtilis . Sekretomet definierades som helheten av alla utsöndrade proteiner och den sekretoriska apparaten hos en bakterie. Med hjälp av en databas med proteinsekvenser från B. subtilis och en algoritm som kontrollerar hydrolysställen som är karakteristiska för utsöndrade proteiner och N-terminala signalpeptider , kunde de förutsäga hur mycket av proteomet som utsöndras av cellen [3] . År 2001 satte samma laboratorium standarden för sekretomik: förutsägelser baserade på endast en aminosyrasekvens är inte tillräckliga för att definiera ett sekretom. De använde 2D elektrofores och masspektrometri för att identifiera 82 B. subtilis -utsöndrade proteiner, av vilka endast 48 förutspåddes baserat på aminosyrasekvensen med den metod som beskrivs i deras tidigare arbete [4] .
Insikten om att det finns många icke-traditionella sekretionsvägar och att många icke-utsöndrade proteiner är en del av den traditionella sekretoriska vägen har skapat ett behov av en djupare definition av sekretomet. År 2010 föreslog Agrawal och kollegor att definiera en hemlighet som "en global grupp av proteiner som utsöndras i det extracellulära utrymmet av en cell, vävnad, organ eller organism vid en godtycklig tidpunkt och under godtyckliga förhållanden genom kända och okända sekretoriska mekanismer, inklusive oreglerade och reglerade sekretoriska organeller » [5] .
Originaltext (engelska)[ visaDölj] vi föreslår en reviderad sekretomdefinition som ''den globala gruppen av utsöndrade proteiner till ECS av en cell, vävnad, organ eller organism vid varje given tidpunkt och villkor genom kända och okända sekretoriska mekanismer som involverar konstitutiva och reglerade sekretoriska organeller''.Föroreningar finns alltid i cellkulturer . Bovint serum från odlingsmediet och cellrester kontaminerar en uppsättning utsöndrade proteiner som används för analys. Förorenande komponenter i bovint serum är särskilt oroande, eftersom många av dem har liknande proteinsekvenser som mänskliga (t.ex. fibronektin och fibulin-1 ) [1] . För att avlägsna föroreningar bör celler tvättas med natriumfosfatbuffert (PBS) eller serumfritt medium (SFM) före inkubation i SFM och uppsamling av utsöndrade proteiner. Alla manipulationer för frisättning av intracellulära proteiner måste utföras noggrant för att undvika cellskador [1] . Dessutom kan inkubationstiden och -förhållandena optimeras så att metabol stress orsakad av bristen på näringsämnen i odlingsmediet inte kommer att påverka sekretomanalysen [6] .
Vissa proteiner produceras i låga koncentrationer och späds sedan ut i odlingsmedier eller kroppsvätskor. Sådana proteiner är svåra att upptäcka. Tekniker för att upptäcka små mängder, såsom utfällning av proteiner med triklorättiksyra , kan användas tillsammans med mycket känsliga metoder som användning av antikroppsmikroarrayer , som kan detektera även enstaka proteinmolekyler [ 7] .
Många sekretomstudier utförs in vitro med användning av cellodlingstekniker. Men det är fortfarande oklart om samma proteiner utsöndras under in vivo-förhållanden . Ett växande antal studier, särskilt de som analyserar tumörsekretom, använder in vivo -metoder för att bekräfta överensstämmelsen i resultaten som erhållits i laboratoriet. Till exempel samlas proximala kroppsvätskor nära tumören för sekretomanalys [1] .
Många utsöndrade proteiner har en N-terminal peptidsekvens som är ansvarig för translokation av det translaterade proteinet till det endoplasmatiska retikulumet (ER) . Proteinbearbetning sker i akuten , vilket så småningom kommer att leda till utsöndring. Närvaron av dessa signalpeptider kan användas för att förutsäga cellens sekretom. Program som SignalP kan identifiera signalsekvenser (och deras hydrolysställen) för att förutsäga proteiner som ska utsöndras. Eftersom transmembranproteiner också bearbetas i ER men inte utsöndras, används program som TMHMM-servern för att förutsäga transmembrandomäner och därmed eliminera falska positiva . Vissa utsöndrade proteiner har inte klassiska signalpeptidsekvenser. Dessa proteiner som saknar en N-terminal sekretorisk ledare kommer att saknas av SignalP. SecretomeP är ett program som har utformats specifikt för att försöka förutsäga icke-klassiska sekretoriska proteiner från deras sekvenser [5] . Genomomfattande sekretom har förutspåtts för ett brett spektrum av organismer, inklusive människor , möss , zebrafiskar och hundratals bakterier [5] .
Metoder för att förutsäga hela genomet har många problem. Det finns en stor sannolikhet för falskt positiva och falskt negativa resultat. Dessutom är genuttryck starkt beroende av miljöförhållanden, vilket innebär att sekretomet som förutspås från genomiska eller cDNA-bibliotek är osannolikt att helt sammanfalla med det sanna sekretomet. För att bekräfta de data som erhållits på detta sätt behövs proteomiska metoder [5] .
Flera genomomfattande sekretom- och kunskapsbaser är tillgängliga baserat på kuration och datorförutsägelser. Dessa databaser inkluderar: Fungal Secretome Database (FSD), Fungal Secretome Knowledge Base (FunSecKB), Fungal Secretome and Intracellular Proteome Knowledge Base (FunSecKB2), Plant Secretome and Intracellular Proteome Knowledge Base (PlantSecKB) och mjölksyra B. Secretome Database . Metazoa Secretome and Intracellular Proteome Database (MetazSecKB) och Protist Secretome and Intracellular Proteome Database (ProtSecKB) har nyligen släppts . Även om det finns vissa felaktigheter i datorförutsägelser, tillhandahåller dessa databaser användbara resurser för att ytterligare karakterisera platsen för proteiner i en cell.
Masspektrometrisk analys är en integrerad del av sekretomik. Serum eller supernatant som innehåller de utsöndrade proteinerna spjälkas av ett proteas , och proteinerna separeras med tvådimensionell gelelektrofores eller kromatografitekniker . Varje enskilt protein analyseras sedan med masspektrometri och det resulterande peptidmasspektrumet kan ses i en databas för att identifiera proteinet [1] .
Att använda den aminosyrabaserade icke-radioaktiva isotopmärkningsmetoden (SILAC) i cellodling kan hjälpa till att skilja mellan utsöndrat protein och föroreningar från bovint serum i cellkultur. Supernatanten från celler odlade i normala medier och celler från media märkta med aminosyror blandas i ett ett-till-ett-förhållande och analyseras sedan med masspektrometri . Proteinföroreningar i serum visar endast en topp eftersom de inte har en märkt ekvivalent [1] . Ett exempel är den framgångsrika användningen av SILAC för att skilja mellan proteiner som utsöndras av mänskliga kondrocyter och föroreningar från serum [8] .
Nyligen har användningen av antikroppsmikroarrayer, en extremt känslig och högeffektiv proteindetektionsmetod, blivit en del av sekretomanalys. Antikroppar eller andra bindemedelsmolekyler är fixerade till ett fast underlag. Därefter tillsätts en blandning av fluorescensmärkt -protein. Signalens intensitet används för att identifiera proteiner. Antikroppsmikroarrayer är extremt mångsidiga: de kan användas för att analysera mängden protein i en blandning, för att analysera andra proteinisoformer , posttranslationella modifieringar och för att analysera proteiners biokemiska aktivitet. Dessutom är dessa mikroarrayer mycket känsliga: de kan upptäcka enstaka proteinmolekyler. Antikroppsmikroarrayer används för närvarande mer för analys av humana plasmaprover , men kan också användas för odlade celler och sekretomanalys av biologiska vätskor , vilket ger ett enkelt sätt att samtidigt upptäcka flera proteiner [7] .
Utöver sin viktiga roll i normala fysiologiska processer spelar utsöndrade proteiner också en viktig roll i karcinogenes , och är involverade i celltillväxt, migration och invasion, och angiogenes . Dessa aspekter gör sektomi till en utmärkt metod för att upptäcka cancerbiomarkörer [9] . Användningen av den proteomiska metoden för att detektera cancerbiomarkörer i biologiska vätskor eller serum kan kompliceras mycket av det faktum att kroppsvätskor är mycket komplexa och heterogena. Sekretomanalys av cancercellinjer i sjuka vävnader representerar ett enklare och mer exakt alternativ för detektion av biomarkörer [6] .
För sekretomanalys av cancer används två huvudtyper av material: supernatanter av cancercellinjer och biologiska vätskor (proximala och vätskor i kontakt med tumören ). Supernatanten av cancercellinjer är den föredragna källan för utsöndrade proteiner. Det finns många odlade linjer tillgängliga och det är lättare att analysera supernatanten än den proximala kroppsvätskan. Men det är fortfarande oklart om hemligheten med cellinjen är en bra representation av den verkliga tumören i dess specifika mikromiljö. Dessutom visar odlade cellinjer inte heterogeniteten hos en riktig tumör [9] . Proximal vätskeanalys kan ge en bättre förståelse av en persons tumörsekretom, men denna metod har också sina nackdelar. Proximala vätskeuppsamlingsprocedurer bör vara standardiserade och godartade kontroller behövs. Dessutom kan förvärvade och genetiska skillnader mellan patienter komplicera analysen [9] .
Sekretomanalys har avslöjat nya potentiella biomarkörer för många typer av cancer, inklusive lungcancer , levercancer , pankreascancer , kolorektal cancer , prostatacancer och bröstcancer . Prostataspecifikt antigen (PSA) , den nuvarande standardbiomarkören för prostatacancer , har låg diagnostisk specificitet: PSA-nivåer går inte alltid att skilja mellan maligna och benigna cancerformer, så en mer specifik biomarkör behövs. Användningen av sekretomanalys av prostatacellinjer i en studie avslöjade flera proteiner närvarande i större mängder i serum hos cancerpatienter än hos friska människor [6] .
Det finns också ett stort behov av biomarkörer för att upptäcka bröstcancer: för närvarande finns det bara biomarkörer för att övervaka de avancerade stadierna av denna typ av cancer [2] . Sekretomanalys av bröstcancercellinjer ledde till upptäckten av leukocytcelladhesionsaktiverande protein (ALCAM) , en ny biomarkör med lovande diagnostisk potential [6] .
Analys av mänskliga embryonala sekretom kan vara användbar i sökandet efter icke-invasiva metoder för att bestämma embryonens livsduglighet . IVF utvärderas enligt morfologiska kriterier för att hitta embryon med hög potential för implantation . Sökning med hjälp av en kvantitativ utvärderingsmetod kan bidra till att minska antalet embryon som används vid IVF och därigenom minska sannolikheten för flerbördsgraviditet . Till exempel, i en studie, skaffa hemliga fingeravtryck för många blastocyster och hitta 9 proteiner som kan skilja sig mellan blastocyster med normala och onormala kromosomtal . Denna metod kommer att ersätta preimplantationsgenetisk diagnos (PGD) , som involverar biopsi av embryonala celler och kan vara skadligt för fostrets utveckling [10] .