Roger Tsien | |
---|---|
engelsk Roger Tsien | |
Födelsedatum | 1 februari 1952 [1] [2] [3] […] |
Födelseort | |
Dödsdatum | 24 augusti 2016 [1] [2] [3] […] (64 år) |
En plats för döden | |
Land | |
Vetenskaplig sfär | biokemi |
Arbetsplats |
UC Berkeley UC San Diego |
Alma mater |
Harvard University Cambridge University |
vetenskaplig rådgivare |
Richard Adrian Jeremy Sanders |
Utmärkelser och priser |
Wolf-priset i medicin (2004) Nobelpriset i kemi ( 2008 ) |
Hemsida | tiolab.ucsd.edu |
Mediafiler på Wikimedia Commons |
Roger Tsien ( Roger Qian , engelsk Roger Tsien , kinesisk 钱永健, pinyin Qián Yǒngjiàn , pall. Qian Yongjian [4] ; 1 februari 1952 – 24 augusti 2016 ) - amerikansk kemist av kinesiskt ursprung, professor vid kemiska institutionen och Biochemistry University of California i San Diego [5] . 2008 tilldelades han Nobelpriset i kemi "för upptäckten och arbetet med det gröna fluorescerande proteinet " tillsammans med två andra kemister [6] .
Roger Yongchin Tsien föddes i New York den 1 februari 1952, den yngsta av tre söner, till Xuezhu Tsien, en maskiningenjör vid Massachusetts Institute of Technology, och sjuksköterskan Ying. Hans familjs anor är kopplade till en linje av lärda-adelsmän från Hangzhou , med ett långt historiskt dokumenterat förhållande till Song-dynastin . Dessutom hade familjen ett ovanligt öde, vilket återspeglade kinesiska historiska händelser under och omedelbart efter andra världskriget. Dess företrädare gjorde ofta karriär i väst, trots misslyckanden och fördomar. Så, Qian Xuesen , en av grundarna av Jet Propulsion Laboratory vid California Institute of Technology , är en kusin till Tsiens far. Tsiens bror, Richard, är också en känd forskare vid Stanford. Roger sa en gång:
"Jag föddes in i det här jobbet."
Rogers far ägde ett litet handelsföretag i New York och arbetade även som ingenjörskonsult i Westchester County. Hans far flyttade sedan familjen till Livingston, New Jersey, när Roger var åtta år gammal. Där arbetade min far med vakuumrör och petrokemikalier för Radio Corporation of America och Esso Research and Engineering.
Som barn led Tsien av astma och tillbringade därför mycket tid inomhus. Han visade ovanligt höga förmågor för vetenskaplig kunskap, som sedan utvecklades till en kärlek till teoretisk och praktisk kemi. Detta började, förutsägbart, med ett intresse för ligandmedierat kromoforbeteende - de färgade övergångarna av metalljoner involverade i ett brett spektrum av klassiska experiment inom oorganisk kemi - och manifesterade sig mest framträdande i försök att syntetisera acetylsalicylsyra , ofta på bakgården, i hushållsrätter och med improviserade instrument. Roger fick sitt första Scoutmärke för sina tjänster inom kemiområdet. Hans anteckningsbok, där han skrev ner sina kemiska experiment som ett åttaårigt barn, förvaras nu på Nobelmuseet i Stockholm [7] .
Talangen för kemi och kärleken till den fanns kvar hos den unge Roger under hans skolår. Han avslutade ett sommarforskningsprogram vid Ohio University 1967 med stöd från National Science Foundation. Studien fokuserade på de omgivande egenskaperna hos tiocyanat (SCN - ) som härrör från den liknande negativa laddningsfördelningen mellan de nukleofila svavel- och kväveatomerna. Denna symmetriska laddningsfördelning antydde möjligheten att bilda en bindning som förbinder två eller flera metalljoner genom bindningen av en N- och S-atom till klass A- respektive B-metaller. Trots att detta arbete inte väckte nöje för Roger och till och med irriterade honom, fick forskningen ändå den högsta utmärkelsen 1968 som en del av Westinghouse Science Talent Search-tävlingen, när han var 16 år gammal [7] .
Roger går sedan till Harvard , där hans intresse för kemi avbröts av universitetets liberala konst. På universitetet träffade Tsien Walter Gilbert i molekylärbiologikurser, Jack Nichols, David Hubel (utländsk medlem av Royal Society of London, 1982) och Torsten Wiesel (utländsk medlem av Royal Society of London, 1982) i kurser i neurofysiologi av de visuella systemen, och med Nelson Kiang vid föreläsningar om hörselsystemens neurofysiologi . Roger började på Phi Beta Kappa i kemi och fysik 1972 och tog examen summa cum laude (cum laude) från Harvard med Detur-priset. Råden från de ovan nämnda lärarna ledde till att Roger framgångsrikt kvalificerade sig för ett Marshall-stipendium som täcker ett doktorandprogram vid Churchill College, Cambridge University , i Physiology Laboratory.
Chefen för hans doktorandprojekt i Cambridge, professor Richard Adrian var intresserad av den cellulära fysiologin för skelettmuskelaktivering ; hon och Tsien blev vänner. Adrian var mer intresserad av att ge studenter av hög intellektuell och vetenskaplig kaliber en chans att utveckla sina ursprungliga ambitioner och självständighet än att rekrytera underordnade som arbetade flitigt och otvivelaktigt under ledning av huvudforskaren. Detta var i allmänhet fallet i det fysiologiska laboratorium som grundades av Hill 1965.
I det vetenskapliga tillvägagångssättet ärvde Tsien Adrians engagemang för laboratoriearbete och nära relationer med ett litet antal kollegor som hade exceptionella egenskaper i en liten forskargrupp. Handledare och student stöttade varandra: år efter examen höll Roger kontakten med sin mentor till slutet av den senares liv.
Studenten attraherades inte av de tillgängliga elektrofysiologiska metoderna (metoder för att registrera egenskaperna hos det extracellulära svaret i individuella neuroner inom en enorm population av det centrala nervsystemet) som användes i arbetet, om så bara på grund av deras svar på enkla sensoriska stimuli. Han hade långa samtal med Richard Adrian om tillämpningen av Laplace-transformen och kabelteorin om dendriter för analys av elektrisk ström i celler som kan exciteras; den första utgjorde därefter grunden för definitionerna av effektiv kapacitans i ett distribuerat nätverk av membran [8] , och diskussioner om kabelteori födde nya "spänningsklämma"-metoder tillämpade på ändlösa kablar [9] .
Roger Tsien var i nära kontakt med kemister som Gerry Smith, Ian Baxter och Jeremy Sanders vid University Chemistry Laboratories, samt Arye Lew och John Kimura med kollegor från Denis Haydons grupp vid Physiological Laboratory. Således, även om Tsien inte var en extrovert av naturen, fick han många vänskapsband och professionella kontakter vid universitetet [7] .
2014 drabbades Tsien av en stroke . Han flyttade med sin fru, Wendy Globe, från San Diego till Eugene, Oregon. Två år senare, 2016, vid 64 års ålder, dog Tsien när han cyklade.
Tsiens arbete ägnades åt utvecklingen av olika metoder för att mäta nyckeljoner och molekyler inom cellfysiologi. Dessa metoder ledde i sin tur till skapandet av verktyg som gjorde det möjligt att skapa viktiga fenomen inom fysiologi och dechiffrera deras mekanismer redan under en forskares liv. Han lämnade också efter sig en kohort av akademiker och forskare [7] .
Tsien studerade ett brett utbud av små fluorescerande molekyler och fluorescerande proteiner, vilket ledde till utvecklingen av viktiga metoder för direkt visualisering av olika viktiga biokemiska processer inom en levande cell och till och med levande organismer. Dessa substanser kan införas i cellen antingen genom deras penetrerande analoger eller genom att uttrycka dem direkt i cellen med användning av molekylärbiologiska tekniker. Vissa av dem kan användas som individuella fluorescerande komponenter, andra kan användas som interagerande par ( FRET ). Detta gjorde det möjligt för dem att användas för att studera en hel klass av cellulära fysiologiska processer, allt från frågan om huruvida generna som är involverade i denna process är påslagna, gå vidare till studiet av uttryck, translokation och interaktion mellan deltagande proteiner och slutar med studiet av själva de fysiologiska processerna som uppstår under interaktionen mellan proteiner [7] .
Tsiens avhandling, färdig 1977, "The Design and Use of Chemical Instruments in Cellular Physiology", belönades med det prestigefyllda Gage-priset i biologi vid Cambridge, samt ett erbjudande om antagning till Comyns Berkeley Research Fellowship-programmet vid Gonville och Caius College . Under denna period började Tsien utvecklingen av kemiska och sedan molekylärbiologiska indikatorer som kan introduceras i en cell eller uttryckas i den för att studera dess fysiologiska processer. Denna uppgift reducerades initialt till att mäta koncentrationen av intracellulärt kalcium, även om efterföljande arbete inkluderade ett mycket bredare spektrum av joner och molekyler. Tsiens intresse för att mäta kalcium kom precis i rätt tid: i slutet av 1970-talet insåg forskarsamhället gradvis kalciums roll i cytosolen som en viktig sekundär budbärare. Belysningen av dess modifiering som föregår triggeraktiverings- eller regleringsstadiet, och kontrollen av denna process genom utbytet mellan fria och bundna cytosoliska fack, intracellulära kalciumdepåer och extracellulärt utrymme, har varit central för att förstå mekanismen för reglering av cellulär aktivitet.
Detta vetenskapliga problem uppstod från direkta mätningar gjorda med elektroder som kan penetrera det inre av en cell som kan exciteras; sådana mätningar användes ursprungligen för att bestämma membranpotentialer [10] . Elektroder selektiva för natrium-, kalium-, väte- och kloridjoner fanns redan vid den tiden och användes i stor utsträckning [11] , men användningen av kalciumselektiva elektroder begränsades av ett antal svårigheter. Elektroderna var föremål för kravet på hög selektivitet med avseende på kalciumjoner mot bakgrund av andra katjoner som potentiellt finns i systemet, inklusive magnesium-, natrium- och vätekatjoner, samt kravet på hög systemstabilitet med minimal hysteres när kalciumet koncentrationsförändringar. Tsien utvecklade mer Ca 2+ -selektiva, neutrala (i motsats till de anjoner som används - organiska fosfater) ligander som sensorer [12] . Dessutom krävdes elektroder med en tillräckligt liten spetsdiameter (cirka 0,4 mikron) [13] för att undvika cellskador, vilket kunde leda till en artefakt - en ökning av lokal kalciumkoncentration. De höga resistanser som krävs för detta, förknippade med elektroden, av storleksordningen 20-30 och 60-120 GΩ i en lösning med p(Ca 2+ ) = 3 och som krävs för att använda en spets med diametrar på 1,5 eller 0,5 μm ledde i sin tur till skapandet av anpassade, skräddarsydda elektrometrar med mycket hög ingångsimpedans och låga stabila förspänningsströmmar (mindre än 10 fA) för att undvika falska signaler.
De experimentella data som erhölls med de optimerade elektroderna uppfyllde det teoretiskt förväntade Nernst-förhållandet mellan utspänningen minus de samtidigt registrerade membranpotentialerna och koncentrationen av fritt kalcium upp till 1 µM i 0,1 M kaliumklorid, med en respons som varar upp till 100 nM [Ca] 2+ ] (Fig. 1). Dessa mätningar överensstämde med data som erhållits genom redan etablerad luminescensspektroskopi i gigantiska muskelfibrer från havstulpaner [14] och grodskelettmuskler [15] . Mätningar i den senare gjordes med användning av aequorin-fluoroforen , som innehåller tre Ca2 + -bindande EF-handmotiv. Aequorin erhölls från maneten Aequorea victoria , som finns i Stilla havet utanför Nordamerikas västkust; ämnet avger en fluorescerande blixt när det exciteras [16] [17] .
Således öppnade elektrodmetoder vägen för kvantitativ bestämning av kalcium i breda koncentrationsintervall, var selektiva med avseende på kalcium mot bakgrund av magnesium- och vätejoner och var tillämpliga i elektrofysiologiska studier. Men för att fastställa kalciumjonernas fysiologiska roll i cellen krävdes en metod som också kunde användas i en lång rad experimentella förhållanden och celltyper. I detta avseende har flera optiska tillvägagångssätt föreslagits bland de tillgängliga fluorescensteknikerna. Optiska metoder visar bättre signalstabilitet mot natriumjoner och snabbare respons jämfört med elektrodmetoder, vilket gör dem lämpliga för att övervaka cellulära händelser. Till skillnad från mätningar vid en specifik punkt gjorde optiska metoder det också möjligt att uppskatta kalciumkoncentrationen i medeltal över vilken region av intresse som helst och karakterisera den rumsliga fördelningen av kalciumjoner med hjälp av tillgänglig konfokalmikroskopi.
Tsiens forskning, i samarbete med Timothy Rink och Tulio Pozzan, bidrog i hög grad till utvecklingen av optiska mätmetoder och gjorde dem till det huvudsakliga tillvägagångssättet som används idag i studiet av kalciumcellfysiologi. Det var nödvändigt att de ligander som utvecklats för detta ändamål visar förmåga att detektera förändringar i emissions- och absorptionsegenskaper under excitationsförhållanden som är kompatibla med signalregistreringsförhållanden och celllivsförhållanden. Dessutom bör molekylerna vara specifika för kalcium och ge förmågan att mäta både stationära och mellanliggande koncentrationer av jonen. Den aequorin luminescerande signalen gav reproducerbara svar på icke-jämviktskoncentrationer, men liganden hade en låg affinitet för jonen, och förhållandet mellan koncentration och signal uttrycktes av en ekvation med en potens av 2,5, vilket avsevärt komplicerade den kvantitativa tolkningen av experimentet. , speciellt när man studerar heterogena jonfördelningar i myoplasman [15] . Fluoroforer som blev tillgängliga senare gav högre affinitet, ett bredare intervall av linjäritet och snabbare association med joner (antipyrylazo-III, << 1 ms; diklorfosfonas-III, <2 ms; arsenazo-III, 2-3 ms) - detta gjorde det möjligt att spåra snabba kalciumökningar i skelettmuskulaturen [18] . Emellertid uppvisade substanser som arsenazo-III och anti-pyrylazo-III variabel kalciumbindningsstökiometri och bildade 1:2 och 2:1 komplex beroende på färgämneskoncentration; de genomgick också stora förändringar i deras adsorptionsegenskaper som svar på magnesium- och vätejoner i närvaro av kalcium [19] . Dessutom kan närvaron av betydande koncentrationer av indikatorn i sig påverka systemet som studeras: till exempel visade antipyrilas III och arsenazo III olika absorptionstidsberoende efter stora långa spänningspulser på cirka -20 mV. Detta ger anledning att tro att en eller båda indikatorerna påverkade kalciumövergångar [20] . Ämnet skulle också potentiellt kunna binda till cytoplasmatiska komponenter eller separera dem i icke-cytosoliska fack – det här är möjliga tolkningar baserade på in vitro -kyvettkalibreringar. Slutligen krävde alla dessa indikatorer introduktion i cellen, vilket påminde om mikroelektrodmätningar. Detta skulle begränsa tillämpningen av metoden till endast tillräckligt starka, väl fästa enstaka stora celler såsom muskelfibrer, jätteaxoner från bläckfisk och retinala celler från Limulus .
Förmågan att ge specifik bindning till kalcium i det senares fysiologiska koncentrationsintervall uppstod från idén om att bilda ett kelatkomplex med fyra karboxylgrupper i den välkända liganden etylenglykol-bis(beta-aminoetyleter) -N,N ,N`,N` -tetraättiksyra (EGTA) ( Fig. 2a), som bildar ett stökiometriskt komplex med en jon med sammansättningen 1:1 [21] . Detta gav upphov till den rationella designen av buffertar med hög affinitet och optiska kalciumindikatorer; det första steget i utvecklingen var ersättningen av metylengrupperna som binder syre och kväve med fenylrester. I en av dessa analoger, 1,2-bis(2-aminofenoxi)etan- N,N , N` , N`-tetraättiksyra (BAPTA), ersätter två bensenringar metylengrupperna som förbinder N- och O-atomerna med bevarande av den övergripande geometrin, specificiteten och affiniteten för molekylen för kalcium (fig. 2b). BAPTA är en allmänt använd och effektiv intracellulär kalciumbuffert, vars bindning, jämfört med EGTA, påverkas mindre av surheten i mediet, är mer selektiv med avseende på kalcium i ett magnesiummedium och har en högre bildnings- och destruktionshastighet av komplexet.
Emellertid absorberar EGTA ljus i den bortre UV-regionen och fluorescerar inte. BAPTA kännetecknas av ett UV-fluorescensspektrum som ändras vid kalciumbindning, med en topp runt 250 nm, vilket inte är bra för fluorescensanalys. Det visade sig att ersättningen av en oxobensen med en metoxikinolinring ledde till uppkomsten av absorptions- och emissionsmaxima vid 340 respektive 492 nm i den nya quin-2-föreningen (Fig. 2c). Dessa våglängder förändrades inte, men fluorescensintensiteten ökade med en faktor sex när kalcium bands. Mätningarna kalibrerades vid typiska vilande cytosoliska kalciumkoncentrationer (10 −7 M) och lägre, ner till 10 −8 M. Andra tillgängliga metoder på den tiden hade en optimal detektion endast vid aktiverat tillståndskoncentrationer (10 −6 M), sedan hur signaler i vila låg redan under detektionsgränsen.
Slutligen resulterade inkubation av celler i lösningar innehållande en membrangenomsläpplig acetometoxieterdel bunden till quin-2 (quin-2-AM) i ett atraumatiskt, permanent inträde av substansen i cellen utan mikromanipulation eller membranavbrott. Efter att molekylen kommit in i cellen skar endogena esteraser ut esterkomponenten och frigjorde den aktiva tetraanjonen (7) som inte passerade genom membranet (fig. 2d). Ökningen i fluorescensintensitet med ökande kalciumkoncentration kunde övervakas med användning av en konventionell kyvettspektrofotometer. Således har quin-2 fått en nyckelroll vid mätning av cytosoliskt kalcium i ett brett spektrum av däggdjursceller och deras suspensioner, inklusive lymfocyter, blodplättar, spermatozoer, neutrofiler och makrofager, särskilt när man studerar kalciums roll i signalresponsprocessen [22] [23] . I framtiden utvidgades denna metod för att introducera förestrade, membrangenomsläppliga derivat i cellen för att studera funktionerna hos kandidatmolekyler för rollen av cellulära budbärare, såsom fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfat, i cellfysiologi [24 ] .
Möjligen på grund av svårigheterna att hitta sysselsättning och oklara jobbutsikter som uppstod för forskare som engagerade sig i tvärvetenskaplig forskning i Storbritannien, accepterade Tsien 1981, efter så betydande forskning, en inbjudan att få ett jobb vid institutionen för fysiologi och anatomi vid universitetet i Kalifornien i Berkeley (vid den tiden leddes institutionen av Terry Manchen) i takt med biträdande professor. Där arbetade Tsien i åtta år, ett av arbetsområdena var vidareutveckling och optimering av kalciumkänsliga ligander i samarbete med Steven Adam och Robert Zucker. Tack vare detta projekt introducerades många reagenser som är extremt utbredda inom cellfysiologi i kommersiell produktion. Alla kom in i cellerna efter inkubation av det studerade systemet med motsvarande AM-derivat. Ämnen som kombinerar en 8-koordinat tetrakarboxylat-kelaterande del med en stilbenkromofor gav förbättrad kalciumselektivitet jämfört med andra dubbelladdade katjoner och endast något lägre affinitet än quin-2 [21] . Affiniteterna för dessa ämnen varierade från Kd = 100 nM (quin-2) till Kd = 90 μM (fluoro-5N), vilket täckte typiska fysiologiska kalciumkoncentrationer i ett brett spektrum av exciterade och vilande celltyper. Högre excitationsvåglängder jämfört med quin-2 (339 nm) gjorde det möjligt att undvika ultraviolett bestrålning av celler, vilket kunde leda till autofluorescens av den exciterade cellen och orsaka dess skada. Införandet av etengruppen av stilben i den heterocykliska ringen förbättrade kvantutbytet och den fotokemiska stabiliteten - fluorescensintensiteten kunde öka upp till 30 gånger. Denna förbättring av extinktionskoefficient och kvantutbyte jämfört med quin-2 (<5000 respektive 0,03 jämfört med 0,14) minskade också mängden märkning som krävdes i systemet (alltså i fallet med quin-2 talar vi om millimolar koncentrationer). Faktum är att stora mängder potentiellt skulle kunna bilda ett buffertsystem med intracellulärt kalcium och störa processen som studeras.
Slutligen, förutom att ändra fluorescensintensiteten hos substanserna, ändrades också våglängderna för kalciumbindningen, medan quin-2 producerade förändringar endast i signalstyrka (detta gjorde mätningen känslig för variationer i bestrålningsintensitet, signaldetektering, ligandkoncentration, och effektiv celltjocklek i optisk stråle). Mätningar med spektrala förskjutningar i absorptions- och/eller emissionsregionen gjorde det möjligt att kringgå dessa källor till artefakter [25] . Således hade indo-1 en dubbel emissionstopp med ett huvudskifte från 475 till 400 nm vid kalciumbindning. Indo-1 har funnit bred tillämpning inom flödescytometri (Fig. 3a). Fura-2 emitterar endast vid en våglängd på 510 nm, men excitationstoppen skiftar från cirka 380 till 350 nm vid bindning, och intensitetsförhållandet är direkt relaterat till jonkoncentrationen. Det höga fotonutbytet av denna förening gjorde det bekvämt att använda även med realtidsvideoinspelning av den lokala koncentrationen av intracellulärt kalcium [26] (Fig. 3b).
Dessa prestationer gav upphov till skapandet av en bred klass av nya detektormolekyler av olika joner och molekyler involverade i fysiologiska processer [27] . För det första gjorde dessa nya varianter det möjligt att mäta koncentrationen av kalcium under olika förhållanden och celltyper. Fluo-3-signalen registreras i det synliga området vid excitation med en argonlaser vid 488 nm, ökar vid bindning vid ett emissionsmaximum vid 525 nm, vilket är nära de värden som detekterats i mätningar med fluoresceinisotiocyanat (FITC) ( Fig. 3c). Dess snabbare dissociation jämfört med fura-2 gör det möjligt att spåra den snabba kinetiken av kalcium i skelett- och hjärtmuskler. Detta har varit särskilt användbart vid registrering av mikroskopiska kalciumfrisättningshändelser ("kalciumblixtar") med konfokalmikroskopi.28 Funktionen har också använts för att registrera de resulterande dolda Ca 2+ -utbredningsvågorna, vilket reflekterar ökad kalciumfrisättning från ryanodinreceptorer i det sarkoplasmatiska retikulumet , som uppstår på grund av bristen på konjugering av kanaler med en transmembran dihydropyridinreceptor i skelett [29] eller proarytmiska omständigheter i hjärtmuskler [30] [31] .
För det andra blev det möjligt att detektera och mäta koncentrationen inte bara för intracellulärt kalcium, utan även för andra deltagare i processerna. Till exempel var karboxylgrupperna i karboxifluoresceinderivatet 2',7'-bis-(2-karboxietyl)-5-(u-6)-karboxifluorescein (BCECF) mer lämpade för att bestämma vätejoner än kalcium. Tillgängligheten för BCECF uppnåddes av en cellpenetrerande AM-analog, och själva ämnet hade en enkel emissionstopp (535 nm) och en dubbel excitationstopp (ca 490 och 440 nm). Dess pKa ( cirka 6,98) och linjära svar mellan pH 6,4 och 7,4 säkerställde dess tillämpbarhet i cellfysiologi i gastriska parietalceller [32] .
För det tredje kunde ljus reversibelt frigöra kalcium från Nitr-2 och utvecklade senare Nitr-5 och DM-nitrofen [33] . Nitr-2 består av en kalciumkelaterande BAPTA kopplad till en nitropiperonylgrupp som kan genomgå fotolys med nära ultraviolett ljus (300–400 nm). Denna händelse ändrar signifikant kalciumdissociationskonstanten från 160 och 630 nM till 7 och 18 µM vid en jonstyrka på 0,1 respektive 0,3 M, vilket frisätter bundet kalcium och därmed ändrar koncentrationen av intracellulärt kalcium [34] (Fig. 4a-c ) ). Egenskapen har funnit tillämpning i fotokemisk kontroll av jonströmmar i neuroner [35] . Tsien utvecklade sedan detta tillvägagångssätt för andra bioaktiva kontroller, och rumslig upplösning uppnåddes genom att fokusera laserkällan för excitation i tre koordinater. Som ett resultat förbättrade koppling av bromerade 7-hydroxikumarin-4-ylmetyler med kandidatmediatorer frisättningsutbytet med användning av tvåfoton, infraröd (i motsats till UV) excitation, och gjorde det möjligt för första gången att erhålla en tredimensionell karta av glutamatkänslighet i sektioner av råttkortikala hjärnneuroner [36] .
Redan innan Tsien flyttade till San Diego 1989 väckte Alexander Glasers arbete med fluorescerande fykobiliproteiner hans intresse för fluorescerande cAMP-spårning. Han ansåg naturliga cAMP-bindande proteiner som grunden för en fluorescerande märkning: detta kan omedelbart ge de nödvändiga affiniteterna och selektiviteterna. I frånvaro av cAMP är fosfokinas A (PKA) inaktivt och dess regulatoriska och katalytiska subenheter är tätt kopplade (Fig. 5). Bindning av cAMP till regulatoriska subenheter leder till dissociation och katalytisk aktivering, vilket möjliggör överföring av fosfat från ATP till vissa specifika proteiner. Att ge enzymet en optisk signal för sådana bindningshändelser förde Roger tillbaka till sina universitetsintressen för fluorescerande resonansenergiöverföring (FRET) mellan två ljuskänsliga kromoforer som är steriskt nära varandra. En exciterad donatorkromofor kan överföra energi till en acceptor på grund av icke-strålande dipol-dipol-interaktion. Detta system konstruerades genom att fästa en typ 1-fluorofor till den regulatoriska subenheten och en typ 2-fluorofor till den katalytiska subenheten. FRET kan uppstå i intakt PKA med nära kontakt mellan subenheter av de två typerna, men borde ha försvunnit vid dissociation efter cAMP-bindning: då skulle signalerna i dessa två situationer observeras vid olika våglängder. Dessa experiment, utförda med gruppen av Suzanne Taylor, kännetecknades av hårt arbete som krävde stor uthållighet: stora mängder rekombinanta PKA-subenheter behövdes. Trots svårigheterna var projektet framgångsrikt och gav upphov till en metod där fluoresceinmärkta katalytiska subenheter binder till rhodaminmärkta regulatoriska subenheter för att bilda cAMP FRET-sensorer [37] . Denna metod har funnit tillämpning i studien av osteoblaster [38] , melanocyter [39] och Aplysia- neuroner [40] .
Användningen av fluorescerande proteiner kompletterade således elegant klassen av ligander med liten molekylvikt. De nödvändiga proteinerna måste emellertid uttryckas och renas i enorma mängder för att selektivt fästa två olika märkningar in vitro till olika proteindomäner eller subenheter samtidigt som proteinernas funktioner bibehålls. Dessutom, i tidigare arbete, måste proteiner också införas i cellen. Dessa svårigheter tvingade forskare att utveckla indikatorer kodade direkt i genomet - i det här fallet var det bara nödvändigt att introducera gener som kodar för två fluorescerande proteiner av rätt färg i cellerna som studerades. Detta tillvägagångssätt hade mycket lägre krav och involverade användningen av etablerade procedurer för transfektion av celler med en liten mängd DNA (jämfört med införandet av protein) med efterföljande selektivt urval av transfekterade celler. Denna uppgift drog Tsiens uppmärksamhet till maneten Aequorea victoria (för andra gången) , en källa till aequorin [16] så användbar i klassiska fysiologiska experiment. Shimomura upptäckte, isolerade och renade grönt fluorescerande protein (GFP) från cirka 10 000 individer, följt av karakterisering av dess fysikalisk-kemiska egenskaper, inklusive spektral, under olika förhållanden. Han visade att GFP är en FRET-excitationsacceptor från aequorindonator och producerar in vivo fluorescens i den gröna regionen av spektrumet, annorlunda än den blå signalen från det renade aequorinpreparatet vid excitation i UV-regionen [41] . Shimomura identifierade också en kromofor p -hydroxibensylidenimidazolindel i proteinkedjan [42] .
Karakteriseringen av en del av GFP-genen av Douglas Prasher [43] initierade ett samarbete i olika laboratorier. Roger har arbetat med produktion och fluorescensegenskaper hos GFP med hjälp av Saccharomyces cerevisiae i samarbete med Roger Heim och Scott Emre. Martin Chalfie (Foreign Fellow of the Royal Society of London, 2018) från delstaten Columbia, som först demonstrerade den UV-inducerade fluorescensen av GFP injicerad i ryggradslösa celler och föreslog den potentiella användningen av proteinet som en biomarkör, har arbetat med dess uttryck i Escherichia coli och Caenorhabditis elegan. Tsiens forskning resulterade i upptäckten av en Y66H (BFP) mutant med förbättrad stabil blå fluorescens i förhållande till den ursprungliga vildtyps-GFP. Ytterligare modifieringar av proteinet, stereokemiskt tillmötesgående tryptofan, ledde till uppkomsten av Y66W-mutanten som kodar för det cyanfluorescerande proteinet (CFP) [44] [45] (Fig. 6a). I FRET-paret ledde konformationsförändringar i strukturen av UV-exciterad BFP till energiöverföring till GFP (Fig. 6b). Detta antydde förmågan hos GFP att exciteras av de blå våglängderna som emitteras av BFP-givaren. GFP-excitationsspektrumet hade dock en stor topp i UV och en liten topp i den blå regionen. Problemet löstes genom att skapa en mutant GFP-variant: den oönskade toppen i UV-regionen försvann, och den blåa ökade cirka 5-6 gånger med en efterföljande +10 nm-skiftning efter S65T-mutationen [45] . I ett försök att testa hypotesen introducerade forskarna en peptidbindning mellan BFP och GFP-S65T-mutanten, såväl som andra mutanter som har en liknande excitationsprofil som GFP-S65T. Selektiv UV-excitering av BFP resulterade verkligen i olika typer av grön och blå emission i närvaro eller frånvaro av FRET-överföring före och efter proteintrypsinolys. Ytterligare tester bekräftade att S65T är den optimala fluoroforen när F64L-mutationen introduceras, vilket ger strukturretention och veckning vid högre temperaturer [46] . Denna dubbelmutant, hänvisad till som "förbättrad (S65T-F64L) GFP", är kommersiellt tillgänglig från Clontech.
Strukturella studier av GFP-S65T avslöjade en cylindrisk struktur med en diameter på 2,4 nm och en längd av 4,0 nm, inklusive 11 β-strängar som omger en axiellt förlängd spiral, i vars centrum en kromofor infördes [47] (Fig. 7 ) ). Således var grupperingen skyddad från effekterna av lösningsmedlet och främmande enzymer, men i hålrummet fanns det utrymme för potentiellt införande av en aromatisk ring, som skulle associeras genom stapling med kromoforen; detta verifierades senare genom att introducera ett antal mutationer, inklusive T203Y, spektrumet av denna variant hade excitations- och emissionsförskjutningar på cirka 20 nm. Det resulterande gula fluorescerande proteinet (YFP) och dess ytterligare mutanta varianter visade sig vara bra signalacceptorer från CFP och bildade alternativa CFP/YFP-par.
Roger bekräftade också bildandet av en kromofor p -hydroxibensylidenimidazolindel från resterna S65, Y66 och G67 i GFP-kedjan [31] . Mekanismen för kromoforens uppkomst involverade en överraskande de novo -bildning av en heterocykel med dehydrering av α-β C-C-bindningen för att bilda en dubbelbindning. För detta behövdes en väteacceptor - Tsien trodde att det var atmosfäriskt syre. Odling av GFP-producerande bakterier under anaeroba förhållanden ledde till att det syntetiserade proteinet inte hade fluorescens, men det visade sig flera timmar efter exponering av proteinet för luft [44] , en egenskap som senare fann sin tillämpning i studien av fysiologi.
Användningen av FRET-avbildning av specifika intracellulära signaler krävde kopplingen av FRET-komponenter till en molekyl som specifikt skulle binda den cellulära komponenten som studerades. I samarbete med Atsushi Miyawaki försökte Roger att fästa donator- och acceptorproteinerna till motsatta ändar av cytosoldomänen av den nyligen klonade inositol-1,4,5-trifosfat (InsP3) receptorn. Troligtvis var detta arbete en återspegling av hans intresse för kemisk signalering mellan cellmembran. Projektet ledde till en förståelse för hur denna viktiga budbärare fungerar i skelettmuskulaturen i excitations-kontraktionsövergången [48] och hur Ca 2+ influxfaktorn [49] fungerar , vilket ger transduktion från intracellulära Ca 2+ depåer till membranytan av depådriven Ca 2 + grind [50] . När det gäller signalering bevisades det senare att processen fortskrider under påverkan av direkt, snarare än kemisk, koppling mellan ytan av L-typ kalciumkanaler och intracellulära sarkoplasmatiska retikulära ryanodinkalciumfrisättningsreceptorer [51] . Men svårigheterna som härrörde från den ofullständiga förståelsen av mekanismen för InsP3-bindning till receptorer tvingade Tsien att rikta sin uppmärksamhet mot utvecklingen av andra intracellulära kalciumdetektorer tillsammans med Mitsushiko Ikura. Detta arbete involverade att fästa BFP och sedan CFP till N-terminalen av calmodulin (CaM). S65T och sedan YFP, tvärtom, fästes till C-terminalen av mål-M13-peptiden. Den slutliga strukturen erhölls genom att kombinera CaM- och M13-fragment [52] [53] .
Genetiskt kodade etiketter ("kameleoner") erhållna på detta sätt, som kan användas under lång tid och kan användas på alla celler eller organismer i vilka sådant DNA kan införas, ledde till uppkomsten av en av de mest populära metoderna för att spåra aktivitet i identifierade neuroner och utökade utbudet av studerade objekt till intakta nervsystem. Dessutom har de tänjt på gränserna för de biologiskt viktiga molekyler som används. Betydande ansträngningar från forskare har lett till upptäckten av linkers som säkerställer fusionen av fluorescerande proteiner med PCA samtidigt som subenheternas förmåga att svara på närvaron av cAMP bibehålls. Sådana proteiner kunde visualisera den subcellulära fördelningen av cAMP i kardiomyocyter efter stimulering med katekolaminer [54] . Slutligen kunde en modifierad kameleont i vilken M13 ersattes av en kinassubstratpeptid och CaM med en proteindomän innehållande en fosfoaminosyrabindande domän som kan binda fosforylerat serin, treonin eller tyrosin visualisera aktiviteten hos kinaser som specifikt fosforylerar serin, treonin eller tyrosin. Fosforylering av dessa rester av kinaset leder till bildandet av ett komplex där avståndet eller orienteringen mellan donator- och acceptorproteinerna ändras [55] . Snart blev denna metod oumbärlig i forskningspraktiken.
Ytterligare utveckling har lagt till arsenalen av fluorescerande proteiner, som täcker ett brett spektrum av spektrumet och möjliggör fotoväxling [56] [57] [58] . Upptäckten och tillgängligheten av genen som kodar för korallrött fluorescerande protein (DsRed) [59] ledde till att Roger gick bortom GFP i sin forskning. DsRed är en tetramer vars kromofordel börjar på samma sätt som i GFP. Ytterligare dehydrering leder emellertid till bildningen av acylimin, som endast är stabil i miljön av det intakta proteinet och visar en långvåglängdsförskjutning i absorptions- och emissionsspektra [60] [61] . Genom riktad evolution skapades ett monomert rött fluorescerande protein (RFP), som är mindre kräsen för fusion med andra proteiner jämfört med tetrameren och blev grunden för en hel uppsättning monomera proteiner, vars emissionsmaxima täckte resten av det synliga spektrumet upp till 648 nm [62] .
Roger hade också ett finger med i att manipulera själva FRET-tekniken, och utövade sina tidiga forskningsintressen inom optiska mätningar av membranpotential. Detta har kunnat förbättras på väletablerade men ofta relativt långsamma eller okänsliga metoder baserade på en enda indikatorfluorofor. Ett tvåkomponents, FRET-baserat tillvägagångssätt använde fluorescerande lektiner som donator, och senare kumarinmärkt fosfatidyletanolamin bunden till utsidan av membranet (fig. 8). Donatorer överförde energi till en laddad transmembran bis(1,3-dihexyl-2-tiobarbiturat)tri (eller penta)metinoxonolacceptor när den passerade från utsidan av membranet till insidan på grund av laddningen när membranpotentialen ändrades. Detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt att uppnå oöverträffad känslighet (för varje 100 mV ökade fluorescenssignalen med mer än 50%) och korta tidskonstanter (mindre än 0,4 ms) jämfört med andra optiska indikatorer [63] .
Mot slutet av sin vetenskapliga karriär kunde Tsien utveckla sådana optiska analysverktyg som användes med särskild framgång i studiet av hela organ eller till och med djur. Dessa verktyg skulle potentiellt kunna användas inom områdena klinisk, neurokirurgisk, kardiovaskulär eller onkologisk medicin. Några av dem utvecklades i samarbete med Nguyen Thao Quyen ( vietnamesiska: Quyến Thẩm Nguyễn ) . En ny fluorescensmärkt F-NP41-molekyl, som lätt förs in i cellen och binder till nerven, och som syftar till att interagera med basalmembranproteinet laminin, kan förbättra den operativa visualiseringen av kroniskt trunkerade nerver [64] [65] , potentiellt förenkla design och kirurgisk implementering av "reparation" nerver [66] [67] . En märkningsteknik för positronemissionstomografi med injicerade erytrocyter märkta med en positronemitterande, multimodal fluorescerande märkning skulle potentiellt kunna användas för att detektera intrakraniell blödning som ett alternativ till 99mTc-märkta substanser [68] och kan vara användbar i experimentella NMR-studier av cerebrala patofysiologiska processer. [69] . Införandet av membranpenetrerande peptider som visar signifikanta förändringar i fluorescens efter att ha skurits av tumörassocierade proteaser inuti cellen kan potentiellt hjälpa till vid tidig diagnos av maligna lesioner [70] . Det har visat sig att både dessa aktiverande peptider och deras gadoliniumbundna dendrimera former selektivt ackumuleras i tumörceller, vilket förbättrar upptäckten av de senare och erbjuder ett sätt för deras framtida NMR-diagnos [71] . Aktiverande peptider har på liknande sätt använts för att selektivt leverera anti-tubulin-radiosensibilisatorn monometylauristatin E till tumörceller, vilket öppnar upp en ny terapeutisk horisont för dessa medel [72] .
Under hela sin karriär har Tsien försökt göra de ligander han utvecklat tillgängliga för kollegor. I den tidiga utvecklingen av quin-2 misslyckades Roger med att övertyga UK National Research and Development Corporation om det kommersiella värdet av en generaliserad struktur som är känslig för kalcium med oöverträffad precision och selektivitet. Senare uttryckte Lancaster Synthesis (nu en del av Johnson Matthey Company Alfa Aesar) intresse för quin-2 och dess AM-derivat. Ett av resultaten av Rogers vetenskapliga verksamhet är cirka 160 amerikanska patent. Tsien grundade också flera företag: tillsammans med Charles Zucker skapade han Aurora Biosciences Corporation, som producerar verktyg för läkemedelsupptäckt med fluorescerande markörer, och Senomyx, som är engagerad i sökandet efter smaklöksmodulatorer. Tack vare hans patent har andra människor också kunnat bilda företag, som Molecular Probes.
Roger delade 2008 års Nobelpris i kemi med Osamu Shimomura ( Woods Hole Marine Biological Laboratory ) och Martin Chalfie ( Columbia University , USA). Kommitténs formulering betonade specifikt Tsiens bidrag till att förstå de fluorescerande egenskaperna hos GFP och relaterade proteiner, vilket ledde till deras tillämpning i studiet av dynamiska processer i levande system. Till ära och respekt för Douglas Prasher, som först började med att studera GFP, bjöd han in Tsien till ceremonin.
Tsien var gift med Wendy Globe. Roger hade inga egna barn; uppfostrade sin styvson Max Rink med sin fru.
Enligt hans vän Christopher Huang, delade Tsien och hans handledare Richard Adrian "liknande vetenskapliga och personliga värderingar, beteenden, en snäll, generös, respektfull attityd mot världen och en utomordentligt ärlig och human attityd mot andra."
Engagerad i amatörfotografering. Han älskade utomhusaktiviteter.
Tematiska platser | ||||
---|---|---|---|---|
Ordböcker och uppslagsverk | ||||
Släktforskning och nekropol | ||||
|
2008 _ _ | Nobelpristagare|
---|---|
Fysiologi eller medicin | |
Fysik |
|
Kemi |
|
Litteratur | Jean-Marie Gustave Leclezio ( Frankrike ) |
Värld | Martti Ahtisaari ( Finland ) |
Ekonomi | Paul Krugman ( USA ) |
Vargpristagare i medicin | |
---|---|
| |
|