Proteinelektrofores i en polyakrylamidgel är en metod för att separera blandningar av proteiner i en polyakrylamidgel i enlighet med deras elektroforetiska rörlighet (en funktion av polypeptidkedjans längd eller molekylvikt , såväl som veckningen av proteinmolekylen, post-translationell ändringar och andra faktorer). Denna metod för protein- och peptidfraktionering används i stor utsträckning inom modern molekylärbiologi , biokemi och genetik .
Ett stort antal modifieringar av proteinelektrofores i polyakrylamidgel har utvecklats för att lösa olika problem och för olika proteiner och peptider. Den vanligaste varianten är proteinelektrofores i polyakrylamidgel i närvaro av natriumdodecylsulfat enligt Laemmli ( SDS PAGE ) .
Den elektroforetiska rörligheten för biopolymerer i en gel beror på ett antal parametrar. Migrationshastigheten är proportionell mot molekylens laddning, och i en fri vätska migrerar molekyler med samma specifika laddning med samma hastighet. Vid separation i ett medium med en stel rumsmatris uppstår segregation på grund av friktion mot gelén. Friktionskraften beror på den rumsliga konfigurationen av molekylen, inklusive dess storlek. Sålunda, i fallet med elektroforetisk separation av naturliga proteiner, kommer ett komplext mönster av deras fördelning att observeras beroende på ovanstående faktorer.
1970 föreslog Laemmli en metod för elektroforetisk separation av proteiner i en polyakrylamidgel beroende på molekylvikten för att studera processen för att sätta samman kapsiden av bakteriofag T4 [1] . För att göra detta, innan applicering på gelén, kokades proverna i närvaro av natriumdodecylsulfat (SDS) och 2-merkaptoetanol. Under påverkan av 2-merkaptoetanol återställs disulfidbindningar, vilket förhindrar de denaturerade polypeptiderna från att loopa ut och öka deras rörlighet. SDS är ett starkt detergent , dess molekyl består av en tolv-ledad alifatisk rak kedja och ett sulfat kovalent bundet till den, som har en negativ laddning i lösning.
När du använder den beskrivna metoden görs följande antaganden:
Under dessa förhållanden har alla polypeptider samma specifika laddning och separeras omvänt med logaritmen för deras molekylvikt. Övning bekräftar riktigheten av dessa antaganden i de allra flesta fall.
För att utföra denaturerande elektrofores i PAAG används olika buffertsystem. Det vanligaste standardsystemet är Laemmli buffertsystem. Dessutom använder de allra flesta verk den så kallade skivelektroforesen (från engelskan discontinuous - discontinuous), det vill säga de använder en gel som består av två delar. Koncentrationsgelen har ett pH på 6,8 och en koncentration av polyakrylamid från 2 till 8%. Den separerande gelén har ett pH i området 8,5-9 och en koncentration av polyakrylamid från 5 till 20%. Valet av geldensitet beror på molekylvikterna för de studerade proteinerna. Alla buffertar innehåller inte oorganiska salter, den huvudsakliga bäraren i dem är glycin . Vid pH 6,8 är den totala laddningen av glycinmolekylen nära noll. Som ett resultat, för att överföra en viss laddning (som bestäms av strömstyrkan i den elektroforetiska cellen), måste negativt laddade komplex av polypeptider med SDS röra sig med hög hastighet. Vid pH 8,8 får glycin en negativ laddning, som ett resultat av vilket proteiner kraftigt hämmas vid gränsen för de koncentrerande och separerande gelerna (mycket fler laddade molekyler är nu involverade i överföringen av samma laddning genom en enhetsarea, därför, de rör sig med lägre hastighet). Resultatet av detta är koncentrationen av proteiner vid gelernas gränssnitt, vilket avsevärt ökar upplösningen av metoden.
I en separerande gel migrerar proteiner beroende på längden på polypeptidkedjan, det vill säga omvänt proportionell mot molekylvikten.
För att visualisera resultaten av elektrofores används oftast färgning av proteiner i geler med Coomassie- färgämne eller silver . För Western blotting överförs proteiner från gelén till ett nitrocellulosamembran.
I de flesta fall är det tillräckligt att erhålla resultaten av elektroforetisk separation genom visuell utvärdering av gelén. Men för att få tillförlitliga data och korrekt dokumentera resultaten skannas gelén genom överföring med en mycket känslig densitometer. Faktum är att en densitometer är en skanner som tillhör styr- och mätinstrument och som är föremål för verifiering för att fastställa och bekräfta att mätinstrumentets egenskaper uppfyller de uppställda kraven. Sådana krav på en densitometer gör det möjligt att på ett tillförlitligt sätt bestämma inte bara positionen för proteiner i gelén, utan också den optiska densiteten hos proteinfläcken. Den digitaliserade bilden av gelén bearbetas med hjälp av specialiserad programvara som gör att du på ett tillförlitligt sätt kan bestämma sådana parametrar som proteinets elektroforetiska rörlighet, dess renhet, mängden protein på platsen, etc.
Bestämning av proteiners molekylviktBestämning av molekylvikten för proteinet som studeras kräver behovet av att kalibrera gelén med molekylvikter. Gelén kalibreras mot molekylvikterna för markörproteiner, som separeras parallellt med testprovet. Blandningar av markörproteiner finns i olika viktområden. Kalibrering involverar att plotta beroendet av den relativa elektroforetiska mobiliteten (Rf) för vart och ett av markörproteinerna på decimallogaritmen för deras molekylvikt. Vanligtvis har beroendet formen av en sigmoidkurva. Beräkningen av molekylvikten för det studerade proteinet utförs i förhållande till dess Rf, med användning av metoden för regressionsanalys . Resultaten anses tillförlitliga om intervallet av markörproteiner är minst 80 % av längden av den separerande gelén, och beroendet av deras Rf på molekylviktens logaritm är linjär (R2 > 0,95). Det vill säga, endast den delen av kalibreringskurvan används för beräkningar, som täcker den elektroforetiska rörligheten hos proteinet som studeras.
Känsligheten för SDS-PAGE-metoden enligt Laemmli är omvänt proportionell mot proteinets molekylvikt. Till exempel, inom intervallet 10-20 kDa , är det möjligt att separera proteiner som skiljer sig med endast 0,1 kDa (skillnaden är endast en aminosyrarest ) . För att få tillfredsställande resultat bör dock några enkla metodrekommendationer följas. På grund av det faktum att den höga elektriska ledningsförmågan hos proverna som studeras avsevärt kan förvränga proteinets elektroforetiska rörlighet, bör deras jonstyrka vara så låg som möjligt och ungefär lika stor. En annan viktig förutsättning för tillförlitligheten av molekylviktsbestämning är den optimala laddningen av proteinet på gelén. Vid färgning med Coomassie Blue R250 bör det optimala proteininnehållet i en fläck vara i intervallet 0,1-1 µg och minst en storleksordning mindre när det färgas med silver. Annars kommer proteinerna i gelén att bilda breda fläckar, vilket gör det svårt att bestämma deras elektroforetiska rörlighet. Trots metodens höga känslighet och enkelhet skiljer sig molekylvikten hos proteiner som bestäms med hjälp av SDS-PAGE ofta från det verkliga värdet. Skillnaden kan variera från några kDa för lågmolekylära proteiner till tiotals kDa för högmolekylära proteiner.
Kvantifiering av proteinerSDS-PAGE-metoden är oumbärlig om det är nödvändigt att kvantifiera ett enskilt protein i ett prov som är komplext inte bara i proteinsammansättningen. Ett exempel på ett sådant prov skulle vara råextrakt eller cellysat. I det här fallet är metoden lämplig för att studera både naturliga proteiner och proteiner som har ändrat sin struktur. Sådana proteiner kan vara polymerer, aggregat eller fullständigt denaturerade molekyler. Metodens relativa anspråkslösa natur med avseende på sammansättningen av provet och det strukturella tillståndet av proteiner i det skiljer SDS-PAGE positivt från andra metoder för kvantitativ bestämning, till exempel högpresterande vätskekromatografi eller enzymimmunanalys.
Kvantifiering av protein med hjälp av SDS-PAGE antyder behovet av att kalibrera gelén i förhållande till beroendet av färgintensiteten hos proteinfläcken i gelén på mängden protein i denna fläck. För att göra detta, parallellt med de studerade proverna, separeras flera referensprover i gelén med exakt kända olika mängder av referensproteinet. Efter visualisering av proteinerna i gelén med hjälp av en densitometer, mäts densiteten för varje proteinfläck i referensproverna. Bestäm beroendet av denna densitet på mängden protein. Den kalibrerade gelén används för att beräkna mängden protein som studeras i förhållande till densiteten av dess fläck med hjälp av regressionsanalysmetoden . Tillförlitliga resultat beaktas om beroendet av tätheten av proteinfläckar för referensproteinet på mängden protein i fläcken är linjär (R 2 > 0,95). Det vill säga, för beräkningar används endast den del av kalibreringskurvan som täcker tätheten av fläcken av proteinet som studeras. Det bör noteras att valet av den optimala proteinkoncentrationen i testprovet utförs empiriskt.
När man kvantifierar proteiner med hjälp av SDS-PAGE, bör en viktig egenskap hos denna metod beaktas. Så, på grund av det faktum att effektiviteten av att färga ett protein i en gel beror på dess natur, till exempel, aminosyrasammansättning, molekylvikt, närvaro av protesgrupper , måste referensproteinet som används för att kalibrera gelen och proteinet som studeras vara identisk. Vid avvikelse från denna regel kan skillnaden mellan det sanna och mottagna beloppet skilja sig åt flera gånger.
Bestämning av proteinföroreningarSDS-PAGE-metoden enligt Laemmli gör det möjligt att kvantifiera innehållet av endast de föroreningar som skiljer sig i sin molekylvikt från molekylvikten hos det undersökta proteinet. För att göra detta separeras testprovet i en gel parallellt med ett eller flera referensprov, vars mängd referensprotein är jämförbar med den förväntade mängden föroreningar i testproteinlösningen. Till exempel, om proteinkoncentrationen i testprovet är 1 mg/ml, och den förväntade mängden föroreningar i det är inom 1 %, används minst en referensproteinlösning med en koncentration på 10 µg/ml som referens prov. Efter visualisering av proteinerna i gelén med hjälp av en densitometer, mäts densiteten för varje proteinfläck för testprovet och referensprovet.
SDS-PAGE-metoden är lämplig för bestämning av proteindimerer och polymerer som ackumuleras på grund av spontan stängning av intermolekylära disulfidbindningar , till exempel under felaktig förvaring av läkemedlet. För att göra detta separeras proteinet som studeras och referensproteinet i en gel under reducerande och icke-reducerande förhållanden. Föroreningar är dimerer och polymerer om de detekteras under reducerande förhållanden och inte detekteras under icke-reducerande förhållanden. I detta fall bör deras molekylvikt vara en multipel av molekylvikten för det testade proteinet. Sålunda gör utvärderingen av renheten hos ett proteinpreparat med SDS-PAGE under reducerande betingelser det möjligt att bestämma endast icke-homologa proteinföroreningar.
Resultaten av att bestämma renheten hos ett prov kan vara antingen semikvantitativa eller kvantitativa. I händelse av att en jämförelse av tätheten av fläckar av kontaminerande proteiner utförs i förhållande till en fläck av ett referensprotein, är det erhållna resultatet semikvantitativt. Dess ordalydelse kan till exempel låta så här: "Innehållet av proteinföroreningar i testlösningen överstiger inte 1 %." Den kvantitativa bestämningen av proteinföroreningar utförs enligt rekommendationerna för kvantitativ bestämning av proteiner med SDS-PAGE-metoden.
Utöver de beskrivna tillvägagångssätten tillämpar vissa laboratorier en metod för att bestämma homogeniteten hos ett preparat utan att använda referensprover. I det här fallet bestäms renheten av proteinet som studeras av densiteten av fläcken i gelén, som uppskattas som en procentandel av summan av densiteterna för alla identifierade proteinfläckar. Detta tillvägagångssätt återspeglar inte den verkliga mängden föroreningar, men kan fungera som en kvalitativ bedömning av läkemedlets renhet. Metoden kan inte klassificeras som kvantitativ på grund av att antalet och densiteten av detekterade proteinfläckar är direkt proportionell mot mängden totalt protein i testprovet och känsligheten hos metoden för att bestämma proteiner i gelén. Dessutom är beroendet av densiteten hos en proteinfläck på mängden protein i den i ett intervall som överstiger en storleksordning ofta inte linjärt.
För proteinelektrofores i en polyakrylamidgel används följande buffertlösningar : Tris - HCl , Tristricin , TBE , TBE med urea, Bis-Tris.