Kapslad polymeraskedjereaktion

Kapslad polymeraskedjereaktion ( engelska  nested PCR  - "nested" PCR) är en tvåstegsvariation av PCR som används för att minska mängden ospecifika reaktionsprodukter [1] . I det första steget amplifieras en region , som inkluderar mål- DNA- fragmentet och dess flankerande sekvenser (det vill säga belägna vid kanterna av fragmentet), till vilken det första paret av primrar är hybridiserat . I det andra steget tillsätts primrar som är komplementära till målfragmentets ändar. Eftersom produkten från det första steget innehåller målfragmentet (det vill säga slutprodukten inuti produkten från det första steget), kallas denna PCR-variation kapslad [1] .

Polymeraskedjereaktion

Polymeraskedjereaktion (PCR) är en DNA-amplifieringsprocess som använder enzymet DNA-beroende DNA-polymeras . En sådan reaktion har funnit bred tillämpning i genetiska laboratorier för att detektera närvaron av en viss del av DNA eller RNA i prover (i det andra fallet är det nödvändigt att först omvandla RNA till DNA genom en omvänd transkriptionsreaktion ). PCR används också inom genteknik för att erhålla det nödvändiga fragmentet och dess vidare användning vid kloning , in vitro- transkription och andra ändamål. Ett viktigt steg för att förbereda reaktionen är valet av primrar som ska hybridiseras vid målfragmentets ändar. I det här fallet hybridiserar primrarna ofta till andra DNA-regioner också, vilket resulterar i en blandning av produkter. Sannolikheten för att detta händer ökar med antalet PCR-cykler [1] .

Primers

Kapslad PCR använder två par primrar tillsatta i två på varandra följande reaktionssteg. Det första paret kallas extern och tjänar till den initiala amplifieringen av platsen, som inkluderar mål-DNA-fragmentet, medan i detta skede ett litet antal temperaturcykler (från 15 till 30) används. Det andra paret, kallat internt, härdas till produkten av det första och används i det andra steget av PCR med ett stort antal temperaturcykler. Eftersom mängden DNA som innehåller målfragmentet ökar exponentiellt efter det första steget , och primrarna som används i varje steg är komplementära till olika sekvenser runt mål-DNA-regionen, ökar den resulterande specificiteten för reaktionen. Detta tillvägagångssätt används ofta för att erhålla sällsynta fragment eller regioner med låg komplexitet (till exempel GC-rika sekvenser) [2] .

Reaktionssteg och protokoll

Det kapslade PCR-protokollet beskrevs första gången 1993 av Kamolvarin och kollegor för diagnos av rabies [3] . Sedan dess har handlingsföljden förblivit praktiskt taget oförändrad [4] . Det ursprungliga protokollet från artikeln beskrivs nedan.

Första steget

Efter RNA-isolering utfördes omvänd transkription med 50 pmol av var och en av paret av externa primers för 1 μg material. Blandningen innehållande RNA/ cDNA - fusionen och primrar gjordes sedan upp till 50 µl med en PCR-buffert innehållande 1,25 U. Taq-DNA-polymeras och 62,5 µmol/l dDNP ( deoxiribonukleosidtrifosfat ). 50 µl mineralolja skiktades ovanpå blandningen och 30 PCR-cykler utfördes (94°C, 1 min (smältning); 45°C, 2 min (glödgning); 72°C, 2,5 min (förlängning)) [ 3] .

I det första steget används ett yttre par av primrar som är komplementära till regionerna runt mål-DNA-fragmentet för att amplifiera detta fragment. Utöver målstället kan primrar även hybridisera till andra ställen. Den slutliga blandningen av produkter från det första steget innehåller både mål-DNA och föroreningar [3] .

Andra steget

För det andra steget av kapslad PCR togs en 2 µl alikvot från den första blandningen och sattes till 23 µl av en blandning innehållande 20 pmol av interna primers komplementära till regionerna av själva målfragmentet, 25 mmol/l dDNF, och 1 enhet Taq DNA-polymeras. Tillbringade 30 cykler av amplifiering med samma program som i det första steget [3] .

I detta fall är sannolikheten för primer-annealing till andra produkter från det första steget extremt låg, och i de flesta fall amplifieras endast mål-DNA-fragmentet [2] [3] .

Användningsexempel

Kapslad PCR används flitigt i uppgifter som kräver hög specificitet, såsom: testsystem [5] , arbete med små mängder material [6] , rening av DNA-prover för vidare analys och användning [7] .

Specifika användningsfall för kapslade PCR:

Anteckningar

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Amplifiering av nukleinsyror  (engelska)  // Diagnostisk molekylärbiologi. - 2019. - S. 215-247 . — ISBN 9780128028230 . - doi : 10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2 .
  2. ↑ 1 2 Haff L A. Förbättrad kvantitativ PCR med hjälp av kapslade primrar.  (engelska)  // Genome Research. - 1994. - 1 juni ( vol. 3 , nr 6 ). - s. 332-337 . — ISSN 1088-9051 . - doi : 10.1101/gr.3.6.332 .
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. Diagnosis of Rabies by Polymerase Chain Reaction with Nested Primers  //  Journal of Infectious Diseases. - 1993. - 1 januari ( vol. 167 , nr 1 ). - S. 207-210 . — ISSN 0022-1899 . - doi : 10.1093/infdis/167.1.207 .
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. Principer och tekniska aspekter av PCR-amplifiering . - [Dordrecht]: Springer, 2008. - 1 onlineresurs (325 sidor) sid. - ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9 , 978-1-4020-6240-7 281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua. Nytt tillvägagångssätt baserad på ett-rörs kapslade PCR och en lateral flow strip för mycket känslig diagnos av tuberkulös meningit  //  PLOS ONE. - 2017. - 30 oktober ( vol. 12 , nr 10 ). — P.e0186985 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0186985 .
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. Användbarheten av en kapslad polymeraskedjereaktion för molekylär diagnos av humant T-cells lymfotropiskt virus typ I/II  //  Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. - 2004. - Juni ( vol. 99 , nr 4 ). - s. 377-380 . — ISSN 0074-0276 . - doi : 10.1590/S0074-02762004000400006 .
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvyagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Ekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. Preparing Unbiased T-Cell and cDNA-bibliotek för djup nästa generations sekvenseringsprofilering  //  Frontiers in Immunology. - 2013. - Vol. 4 . — ISSN 1664-3224 . - doi : 10.3389/fimmu.2013.00456 .
  8. ↑ Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. Utveckling av en mycket känslig kapslad-PCR-procedur med användning av ett enda slutet rör för detektion av Erwinia amylovorain asymptomatiskt växtmaterial  //  Tillämpad och miljömikrobiologi. - 2000. - 1 maj ( vol. 66 , nr 5 ). - P. 2071-2078 . — ISSN 1098-5336 . - doi : 10.1128/AEM.66.5.2071-2078.2000 .
  9. ↑ Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. Utveckling av en kapslad-PCR-analys för snabb detektering av Pilidiella granati i granatäpplefrukt  //  Vetenskapliga rapporter. - 2017. - 20 januari ( vol. 7 , nr 1 ). — ISSN 2045-2322 . - doi : 10.1038/srep40954 .
  10. ↑ Guo Ping , Yu Yongxin , Pan Yingjie , Yan Shuling , Wang Yongjie. Design och utvärdering av kapslade PCR-primrar för specifik detektion av norovirus från genogrupp I i ​​ostron  //  Molecular and Cellular Probes. - 2018. - Augusti ( vol. 40 ). - S. 40-43 . — ISSN 0890-8508 . - doi : 10.1016/j.mcp.2018.06.002 .
  11. ↑ Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. Användning av kapslad PCR för detektion av trichomonads i bronkoalveolär sköljvätska  (engelska)  // BMC Infectious Diseases. - 2019. - 10 juni ( vol. 19 , nr 1 ). — ISSN 1471-2334 . - doi : 10.1186/s12879-019-4118-9 .
  Gå till Wikidata-objektet  Ordböcker och uppslagsverk