Länkad immunosorbentanalys
Den aktuella versionen av sidan har ännu inte granskats av erfarna bidragsgivare och kan skilja sig väsentligt från versionen som granskades den 30 juni 2022; kontroller kräver 11 redigeringar .Enzyme immunoassay (förkortat ELISA , engelsk enzym-linked immunosorbent assay, ELISA ) är en laboratorieimmunologisk metod för kvalitativ eller kvantitativ bestämning av olika lågmolekylära föreningar, makromolekyler, virus etc., som är baserad på en specifik antigen - antikroppsreaktion . Detekteringen av det bildade komplexet utförs med användning av enzymet som en märkning för signalregistrering. De teoretiska grunderna för ELISA bygger på modern immunkemi och kemisk enzymologi, kunskap om de fysikalisk-kemiska lagarna för antigen-antikroppsreaktionen, samt på de grundläggande principerna för analytisk kemi.
ELISA är ett av de mest aktivt utvecklande områdena inom kemisk enzymologi. Detta beror på det faktum att i ELISA kombineras den unika specificiteten hos den immunkemiska reaktionen (dvs. antikroppar binder uteslutande till vissa antigener och inte till några andra) med en hög känslighet för enzymmärkningsdetektering (upp till 10–21 mol i ett prov). Den höga stabiliteten hos reagenser, enkelheten med registreringsmetoder, möjligheten att skapa kaskadsystem för att förstärka olika kemiska signaler, det relativt låga priset och många andra fördelar med ELISA-metoden har bidragit till dess utbredda implementering inom olika områden av medicin, jordbruk. , mikrobiologiska och livsmedelsindustrier, miljöskydd och även inom vetenskaplig forskning. [ett]
Teoretiska grunder
På grund av mångfalden av studieobjekt - från föreningar med låg molekylvikt, peptid- och steroidhormoner, farmakologiska preparat, bekämpningsmedel, till virus och bakterier och till och med andra antikroppar - mångfalden av bindningsprinciper och mångfalden av villkor för att genomföra ELISA, det finns ett stort antal alternativ för denna metod. Enbart för registrering av enzymatisk aktivitet är det möjligt att använda fotometriska, fluorometriska, bio- och kemiluminescerande metoder, och i vissa fall (särskilt de som är förknippade med att lösa tekniska problem), används elektrokemiska och mikrokalorimetriska sensorer framgångsrikt.
Fysikaliska och kemiska baser för interaktion
Den immunkemiska reaktionen i lösning fortgår i flera steg, av vilka det första är den reversibla bildningen av ett komplex mellan antikroppar och antigener med en sammansättning av 1:1 (på grund av närvaron av mer än ett bindningsställe i antikroppsmolekylen för polyvalenta antigener ytterligare flerstegsbildning av komplexa komplex med olika förhållanden av komponenter är möjlig). Komplexbildning medieras av hydrofoba , joniska , van der Waals och vätebindningar . Den viktigaste rollen spelas av krafterna för hydrofob interaktion, som stabiliserar hela systemet (minskar dess fria energi samtidigt som entropin ökar ). Effektiviteten av sådana interaktioner ökar med ökande temperatur.
I det enklaste fallet kan interaktionen av ett antikroppsbindningsställe ( AT ) med ett monovalent antigen ( AG ) representeras av schemat
.
På den kvantitativa sidan kännetecknas specificiteten av antigen-antikroppsinteraktionen genom affiniteten hos antikroppar eller jämviktskonstanten för bildandet av immunkomplexet Ka (inneboende affinitet, l / mol):
,![{\displaystyle Ka={\frac {[AG\times AT]}{[AG]\times [AT]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/7e8f78018bc8a191a4a4a20846f450a7ef639a94)
där [ AG ], [ AT ] och [ AG × AT ] är jämviktskoncentrationerna av fritt antigen, fri antikropp respektive antigen-antikroppskomplex. I praktiken används ofta jämviktsdissociationskonstanten för komplexet Kd (mol/L) , relaterat till Ka genom ett enkelt förhållande
Uppenbarligen, ju mindre Kd (eller, omvänt, ju större Ka ), desto starkare blir det resulterande immunkomplexet.
Komplexbildningskonstanten är en termodynamisk parameter som kännetecknar förändringen i den fria energin hos antigen-antikroppsinteraktionen, som kan beräknas med formeln:
,
där R är gaskonstanten, T är den absoluta temperaturen. Den totala förändringen i fri energi under komplexbildning är summan av två termodynamiska storheter - förändringar i entalpi och entropi :
.
Antigen-antikroppsreaktionen fortskrider med frigöring av värme, men som regel är förändringen i entalpi liten och uppgår till cirka 40 kJ/mol. Förändringen i entropi är i de flesta fall positiv, eftersom de aktiva centran av antikroppar i fri form är tillgängliga för lösningsmedlet och är hydratiserade, och när de interagerar med antigenet frigörs bundna vattenmolekyler från dem, vilket leder till en minskning av den övergripande ordningen av systemet. På tal om antikroppars immunologiska specificitet utförs alltid en jämförande bedömning av effektiviteten av en antigen-antikropp, som kännetecknas av en jämviktskonstant eller en förändring i systemets fria energi under komplexbildning.
Interaktion av ett antigen med en subpopulation av antikroppar
Tidigare togs en enkel modell av interaktionen mellan ett monovalent antigen och en monovalent antikropp som grund för en kvantitativ beskrivning av effektiviteten av antigen-antikroppsinteraktion. Men eftersom antikroppsmolekylen har flera antigenbindande centra och dessutom kan interagera med flera antigena determinanter av en antigenmolekyl, är denna egenskap hos bildandet av ett immunkemiskt komplex mycket förenklat. För att beskriva processen för interaktion mellan en polyvalent antikropp och ett polyvalent antigen, som ligger närmare verkligheten, har termen aviditet , eller funktionell affinitet ( funktionell affinitet ), introducerats. Ur biologisk synvinkel är det funktionell affinitet som spelar huvudrollen i immunsvaret på infektion av kroppen med virus eller bakterier som har upprepade antigena determinanter på sin yta.
Processen för bildning av ett 1:1 antigen-antikroppskomplex, i vilket polyvalenta interaktioner realiseras, är också reversibel och kan karakteriseras av komplexbildningskonstanten . Ur en energisk synvinkel är bildandet av ett polyvalent komplex mycket mer fördelaktigt än ett monovalent. Till exempel kan den effektiva komplexbildningskonstanten för IgG vara 1000 eller fler gånger större än enkelbindningskonstanten.
Katalytiska egenskaper hos enzymer
En mycket viktig och ofta använd i praktiken egenskap hos enzymer är deras katalytiska aktivitet . En enhet av katalytisk aktivitet (1 katal) av vilket enzym som helst tas som en sådan mängd som katalyserar omvandlingen av 1 mol substrat till 1 s i reaktionsblandningen under vissa förhållanden. För praktiska ändamål är nanokatal ( 10–9 katter ) det bekvämaste. Den gamla beteckningen för katalytisk aktivitet, känd som den internationella enheten ( IU , engelska U ), används fortfarande ofta , definierad som mängden enzym som katalyserar omvandlingen av 1 mmol av substratet på 1 min. Förhållandet mellan dessa enheter är som följer:
1 nkat \u003d 10 −9 cat \u003d 0,06 U.För en jämförande bedömning av olika enzympreparat används ofta specifik katalytisk aktivitet , det vill säga katalytisk aktivitet per massaenhet av proteinet.
Hastigheten för en enzymreaktion påverkas av olika faktorer, bland vilka de viktigaste är:
- temperatur,
- buffertens natur och pH ,
- substrat,
- koenzymer ,
- effektorer,
- mängden protein i systemet.
Temperaturberoendena har en komplex form, vilket beror både på termolabiliteten hos proteinmolekyler och på inverkan av temperaturen på Michaelis -konstanterna, hastighetskonstanterna för nedbrytningen av individuella enzym-substratkomplex och positionen för pH - optimum. Vid låga temperaturer, när strukturen av det aktiva centret är tillräckligt stabil, beskrivs hastighetskonstanten för nedbrytningen av enzym-substratkomplexet med en ekvation av Arrhenius -typ .
Området för pH -optimal aktivitet kan vara ganska snävt. Det beror på jonstyrkan och typen av buffert som används, och ändras med temperaturen. Till exempel, för alkaliskt fosfatas är pH -optimum vid temperaturer på 37, 30 och 25 °C 9,9; 10.1 respektive 10.3.
Den bestämda katalytiska aktiviteten beror starkt på det använda substratet, vilket kan vara både naturligt och syntetiskt, medan deras omvandlingshastigheter också varierar avsevärt. Till exempel hydrolyserar enzymet β -D- galaktosidas de syntetiska substraten 2-nitrofenyl-β- D - galaktosid och 4-nitrofenyl-β- D - galaktosid, 7 respektive 17 gånger snabbare än det naturliga substratet laktos.
Effektorer inkluderar både inhibitorer och aktivatorer av enzymatiska reaktioner, det vill säga ämnen som har en långsammare eller accelererande effekt på omvandlingen av substratet. I vissa fall hämmas enzymatiska reaktioner av höga koncentrationer av substratet eller av en av reaktionsprodukterna. Närvaron av effektorer i reaktionsmediet kan leda till en oönskad avvikelse av den enzymatiska reaktionshastigheten från ett linjärt samband med mängden enzym i systemet.
Experimentella metoder för att bestämma enzymatisk aktivitet
Fotometrisk metodI ELISA, den mest använda fotometriska metoden för att registrera enzymaktivitet. I detta fall används ämnen som enzymsubstrat, vars omvandlingsprodukter är färgade föreningar eller, omvänt, färgen på själva substraten förändras under reaktionen. Färgade föreningar absorberar synligt ljus, det vill säga elektromagnetisk strålning med våglängder på 400-700 nm. Ljusabsorption följer Bouguer-Lambert-Beer-lagen , enligt vilken den optiska densiteten för en lösning i ett visst område är direkt proportionell mot koncentrationen av ämnet. En spektrofotometer används för att mäta optisk densitet.
Fluorimetrisk metodPå senare tid har substrat blivit utbredda i ELISA, som bildar produkter som detekteras med den fluorimetriska metoden . När en molekyl absorberar en foton, går den från det elektroniska marktillståndet till ett exciterat. En exciterad molekyl kan återgå till grundtillståndet, medan överskottsenergin förvandlas till värme, men den omvända processen för elektronövergång till marknivån kan inträffa, åtföljd av frigörandet av ett ljuskvantum, vilket kallas fluorescens. På grund av den partiella förlusten av energi under övergången av molekylen från det exciterade tillståndet till grundtillståndet, är våglängden för det emitterade ljuset alltid större än våglängden för det absorberade ljuset. Den andel av molekyler som har passerat från det exciterade tillståndet till grundtillståndet med ljusemission bestäms av kvantutbytet Φ. Fluorescensintensiteten är proportionell mot mängden ljus som adsorberas av provet. Således är den direkt proportionell mot koncentrationen av det lösta ämnet och det absoluta värdet av den initiala ljusintensiteten, medan fotometri jämför de relativa intensiteterna som adsorberas av provet. Detta faktum gör det möjligt att öka känsligheten för bestämning av ett ämne i lösning med den fluorimetriska metoden med 1–2 storleksordningar jämfört med den fotometriska metoden.
Bioluminescens och kemiluminescensSom detektionssystem i ELISA har enzymatiska reaktioner använts, vars energi realiseras i form av ljusstrålning - reaktioner av bio- och kemiluminescens . Hastigheten för sådana reaktioner övervakas av intensiteten hos reaktionssystemets glöd, registrerad med användning av en luminometer. Bioluminescensreaktioner katalyseras av luciferaser från eldflugor och bakterier, och reaktionen av oxidation av cykliska hydrazider med väteperoxid (kemiluminescensreaktion) katalyseras av pepparrotsperoxidas.
Elektrokemisk metodÄven kända är elektrokemiska metoder för att bestämma aktiviteten hos enzymer som används som markörer i immunanalyser. Sådana sensorer gör det möjligt att bestämma hastigheten för enzymatiska reaktioner i grumliga medier och är bekväma för att skapa genomflödesimmunanalysceller.
I enzymimmunoanalysmetoder kan både enzymer och deras substrat användas som märkningar för antigener och antikroppar. Om en enzymmolekyl fungerar som en märkning, bör den valda detektionsmetoden säkerställa registreringen av en signal proportionellt beroende på enzymkoncentrationen, och i fallet med ett substrat som används som märkning, på substratkoncentrationen. I det första fallet fungerar enzymet som en markör (det är kovalent bundet till ett antigen eller en antikroppsmolekyl), i det andra fungerar det som en detektor (fritt enzym). Efter att ha utfört alla immunokemiska steg i någon ELISA-metod är det nödvändigt att fastställa koncentrationen av den enzymmärkta komponenten i den immunkemiska reaktionen, det vill säga för att bestämma den katalytiska aktiviteten hos enzymet i provet. Den observerade reaktionshastigheten används för att bedöma koncentrationen av markörenzymet i systemet. Det bör noteras att ELISA alltid är baserad på en jämförande bestämning under identiska förhållanden för standardprovet och det uppmätta provet, och därför är kravet på proportionalitet av hastighet och koncentration mer önskvärt än obligatoriskt. Det är tillräckligt att det finns en en-till-en-överensstämmelse mellan mängden av den bildade enzymatiska reaktionsprodukten och mängden enzym i systemet. Uppfyllelsen av proportionalitetsvillkoret i ett visst koncentrationsområde säkerställer dock större noggrannhet av experimentet och gör det möjligt att konstruera en teoretisk modell som beskriver metoden för dess optimering.
Enzymer som används som etiketter i ELISA
Den grundläggande möjligheten att använda enzymer som markörer i ELISA beror på den extremt höga känsligheten för detektion av enzymer i lösning. Om konventionella spektrofotometriska eller fluorimetriska metoder kan registrera bildandet av en produkt vid en koncentration av 10 −7 mol/l, så blir koncentrationen av enzymet 10 −13 mol/l. Dessutom är det i grunden möjligt att signifikant reducera detektionsgränserna för enzymer både genom att öka tiden för den enzymatiska reaktionen och genom att öka känsligheten för registrering av den bildade produkten. I detta avseende är lovande luminescerande metoder för att detektera enzymatiska reaktioner, såväl som metoder baserade på enzymatisk förbättring av detektionen av produkter från den primära enzymatiska reaktionen ("kaskader").
Det finns ett antal generella krav för val av enzymmärkning i ELISA. De viktigaste är följande:
- hög specificitet och specifik katalytisk aktivitet, vilket gör det möjligt att detektera markören vid låga koncentrationer;
- tillgängligheten av enzymet, möjligheten att erhålla tillräckligt rena enzympreparat som bibehåller hög aktivitet efter kemisk modifiering vid erhållande av ett konjugat med antigener eller antikroppar;
- stabilitet under optimala förhållanden för interaktionen av antigenet med antikroppen;
- enkelheten och känsligheten hos metoden för att bestämma koncentrationen av enzymet.
De mest utbredda inom heterogen ELISA (som använder reagens immobiliserade på ytan av fasta bärare) är pepparrotsperoxidas , alkaliskt fosfatas och β -D- galaktosidas . Alla tre enzymerna bestäms vid nivån av picomolära koncentrationer.
Den mest tillgängliga är pepparrotsperoxidas. Den innehåller kolhydratrester som lätt oxideras av perjodat, genom vilka enzymet kan binda till antikroppar eller antigener. Sammansättningen av substratsystemet för att mäta aktiviteten av peroxidas med den fotometriska metoden inkluderar kromogener, som ger färgade föreningar vid oxidation med peroxid.
Den katalytiska aktiviteten av glukosoxidas registreras med samma kromogener som aktiviteten för peroxidas, men känsligheten för dess bestämning jämfört med peroxidas är något lägre. Den största fördelen med enzymet är dess fullständiga frånvaro i blodplasma, vilket gör det möjligt att använda detta enzym i homogena ELISA-metoder (reagenser för alla stadier av ELISA är i vattenlösning).
Alkaliskt fosfatas och dess konjugat har hög stabilitet och låg detektionsgräns, men har en relativt hög kostnad. Superkänsliga enzymsystem har utvecklats som gör det möjligt att detektera upp till flera tusen alkaliska fosfatasmolekyler i lösning, baserat på användningen av en NADP- molekyl som substrat . NAD- produkten som resulterar från enzymatisk hydrolys bestäms i det enzymatiska kofaktorregenereringssystemet.
β -D- galaktosidas är också ett brett använt enzym i både homogen och heterogen ELISA. Det katalyserar hydrolysen av laktos för att bilda glukos och galaktos. Om 4-metylumbelliferyl-β- D - galaktosid tas istället för det naturliga substratet, bildas galaktos och 4-metylumbelliferon vid hydrolys, vilket detekteras fluorimetriskt.
Alla kommersiella testsystem använder pepparrotsperoxidas, vars val bestäms av dess höga specifika katalytiska aktivitet, tillgänglighet, stabilitet och lätthet att detektera. Orto-fenylendiamin (OPD) eller tetrametylbensidin (TMB) med väteperoxid används oftast som substratreagens, vars oxidationsprodukt registreras fotometriskt. För att stoppa den enzymatiska reaktionen används ett "stoppreagens", som tillsätts till alla test- och kontrollprover i lika stora mängder. Oftast används svavelsyra som "stoppreagens". Redovisning av resultaten utförs spektrofotometriskt vid en våglängd av 450-490 nm.
Klassificering av ELISA-metoder
Hittills har ett stort antal olika alternativ för att genomföra ELISA utvecklats, med både grundläggande och mindre skillnader. Det finns ingen enskild tydlig klassificering av hela mängden ELISA-metoder i litteraturen, vilket gör det svårt att identifiera gemensamma mönster och göra en jämförande bedömning av olika metoders kapacitet. Vanligtvis utförs övervägandet av ELISA-metoder från synvinkeln av separation i heterogen och homogen, det vill säga enligt principen att utföra alla steg av analys med deltagande av en fast fas eller endast i lösning.
Den primära processen i ELISA är stadiet för "igenkänning" av den analyserade föreningen av en antikropp som är specifik för den. Eftersom processen för bildning av immunkemiska komplex sker i ett strikt kvantitativt förhållande, på grund av affinitet, koncentrationer av komponenter och reaktionsförhållanden, är det tillräckligt att bestämma den initiala koncentrationen av den analyserade föreningen är en kvantitativ bedömning av de resulterande immunkomplexen. När det gäller antigenanalys finns det två sätt att göra denna bedömning:
- direkt mätning av koncentrationen av de bildade komplexen;
- bestämning av koncentrationen av kvarvarande fria (oreagerade) antikroppar.
Uppenbarligen, i det senare fallet, bestäms antalet bildade immunkomplex av skillnaden mellan det totala antalet tillsatta antikroppar och antalet antikroppar som förblir fria.
Klassiska ELISA-metoder bygger på bildning av en fällning (fällning) av antikroppar i närvaro av ett antigen, dock krävs höga koncentrationer av komponenter och lång reaktionstid för visuell registrering av fällningsprocessen. Dessutom kan resultaten av en sådan analys inte alltid entydigt tolkas och i de flesta fall är de av kvalitativ eller semikvantitativ karaktär. För många monovalenta antigener ( haptener ), såsom hormoner och läkemedelsföreningar, är dessa metoder dessutom olämpliga. Indikeringen av det bildade antigen-antikroppskomplexet i lösning kan utföras om en märkning införs i en av de initiala komponenterna i reaktionssystemet, som lätt kan detekteras med motsvarande mycket känsliga fysikalisk-kemiska metod. Isotopiska, enzymatiska, fluorescerande, paramagnetiska etiketter visade sig vara mycket lämpliga för detta ändamål, vars användning gjorde det möjligt att öka känsligheten för immunokemiska metoder miljontals gånger och minska analystiden till flera timmar. Eftersom komplexbildningsprocessen sker i strikt kvantitativ mening, är koncentrationen av markören som ingår i komplexet unikt relaterad till den initiala koncentrationen av antigenet.
Heterogen ELISA i mikroplattformat
För att analysera effektiviteten av komplexbildning är det nödvändigt att fullständigt rena komplexen från fria komponenter. Detta problem visade sig vara lätt att lösa om en av komponenterna i antigen-antikroppsparet är fast bunden ( immobiliserad ) på en fast bärare. Immobilisering gör det möjligt att förhindra aggregering i lösning och att fysiskt separera de resulterande komplexen från fria komponenter. Användningen av immobilisering av antikroppar på en fast bärare lade grunden för metoder för fastfas (heterogen) ELISA .
Av särskild betydelse för det utbredda införandet av fastfas-ELISA i praktiken var utvecklingen av speciella polystyrenplattor innehållande 96 brunnar som bärare för sorptionsimmobilisering av antikroppar och antigener. Faktumet med sorption av antikroppar på ytan av polystyren fastställdes i mitten av 60-talet och användes initialt i metoderna för radioimmunoanalys (RIA) . Införandet av polystyrenskivor i praktiken av ELISA gjorde det möjligt att avsevärt öka antalet utförda analyser och förenkla det metodologiska förfarandet för dess implementering. Speciella anordningar utformades för att automatisera stegen med tillsats av reagens, tvättning och samtidigt registrering av den katalytiska aktiviteten av märkningsenzymet i varje brunn på plattan. [ett]
Heterogen (fastfas) ELISA i en mikroplattversion används mest i testsystem för kliniska laboratoriestudier. Som en fast fas används ytan på brunnarna på en polystyrenmikroplatta, på vilken de kända antigenerna eller antikropparna som ingår i testsystemet adsorberas (kallas i detta fall immunosorbent ). Under loppet av en specifik reaktion av immunosorbenten med antikroppar eller antigener som bestäms i testprovet, bildas immunkomplex, som fixeras på den fasta fasen. Ämnen som inte deltog i reaktionen, såväl som överskott av reagens, avlägsnas under upprepad tvättning. Konjugat används - antikroppar mot ämnet som ska detekteras, kopplade till en specifik märkning (till exempel enzymet pepparrotsperoxidas , alkaliskt fosfatas , β-D-galaktosidas, rutenium eller fluorescein), som är en katalysator för den enzymatiska reaktionen. [2] Detta schema gör det möjligt att förenkla processen för effektiv separation av reaktionskomponenterna. [3]
Icke-konkurrenskraftiga ELISA-metoderOm endast den analyserade föreningen och dess motsvarande bindningscentra (antigen och specifika antikroppar ) finns i systemet, är metoden icke-konkurrenskraftig .
Direkt ELISAAnvänds för att bestämma antigenet. Kan göras på två sätt. I den första fixeras det införda materialet (antigen) under inkubation på ytan av rena brunnar. Mängden testmaterial detekteras med användning av konjugatet. I den andra immobiliseras antikropparna på brunnen och testsubstansen, som tidigare märkts med enzymet, detekteras.
Analysstruktur.
Biologiskt material (blod, avskrap från slemhinnor, utstryk) placeras i rena brunnar under en tid (vanligtvis 15-30 minuter), tillräckligt för att antigener ska fästa vid brunnarnas yta.
Därefter tillsätts märkta antikroppar mot det detekterade antigenet (konjugatet) till brunnarna. Det betyder att vid detektering av antigener, till exempel syfilis, tillsätts antikroppar mot syfilisantigener. Denna blandning får stå under en tid (från 30 minuter till 4-5 timmar) så att antikropparna i konjugatet kan hitta och binda till "sitt" antigen. Ju fler antigener i ett biologiskt prov, desto mer antikroppar kommer att binda till dem. Eftersom antikroppar tillsätts i överskott kommer inte alla av dem att binda till antigener, och om det inte finns något antigen i provet alls, kommer följaktligen inte en enda antikropp att binda till det önskade antigenet. För att avlägsna "extra" antikroppar hälls innehållet i brunnarna ut (eller sköljs ut genom dekantering ). Som ett resultat återstår endast de som har kommit i kontakt med antigenerna "limmade" på brunnarnas yta.
Nästa steg är den enzymatiska reaktionen. Tillsätt en lösning med enzymet i de tvättade brunnarna och låt stå i 30-60 minuter. Detta enzym har en affinitet för den substans (specifik märkning) som antikropparna är bundna till. Enzymet utför en reaktion, som ett resultat av vilken denna specifika märkning (substrat) omvandlas till en färgad substans (produkt).
Kort schema: (Antigen) → Antikropp
Eftersom den tillsatta specifika märkningen är associerad med antikroppar i den första metoden eller med ett märkt antigen i den andra, betyder det att koncentrationen av den färgade reaktionsprodukten är lika med koncentrationen av analyten. [2]
Indirekt icke-konkurrenskraftig ELISAAnvänds för att detektera antikroppar. Det biologiska testmaterialet (oftast humant serum eller plasma), som innehåller eller inte innehåller antikroppar mot antigenet, införs i brunnarna, på vars fasta yta antigenet preliminärt sorberas. Antalet bundna antikroppar detekteras med hjälp av ett konjugat till dem.
Analysstruktur.
De testade antikropparna från det införda provet av biologiskt material binder till antigenet under inkubation och immobiliserar sålunda på ytan av brunnen. Obundna antikroppar avlägsnas genom tvättning.
Ett konjugat med förmåga att binda till antikroppen som immobiliserats i det första steget införs i brunnen. Om cellen innehåller immunkomplex bildade i det första steget, kombineras konjugatet med dem under den andra inkubationen, och det obundna konjugatet avlägsnas genom efterföljande tvättning.
Därefter tillsätts ett substrat-kromogent reagens till brunnen, som förvandlas till en färgad produkt under påverkan av enzymkomponenten i konjugatet. [3]
Kort schema: Antigen → (Antikropp) → Antikropp-K
Skillnaden från den direkta metoden är alltså att de testade antikropparna inte fastnar på ytan av en ren brunn, utan binder till antigenet som är immobiliserat på plattan.
"Smörgås"Används för att bestämma antigenet. "Sandwich" är en variant av indirekt icke-kompetitiv heterogen ELISA i vilken primära antikroppar är immobiliserade på plattan. [3]
Analysstruktur.
En lösning innehållande det analyserade antigenet sätts till bäraren med immobiliserade antikroppar. I inkubationsprocessen i det första steget bildas ett antigen-antikroppskomplex på den fasta fasen.
Sedan tvättas bäraren från obundna komponenter och konjugatet tillsätts.
Efter den sekundära inkubationen och avlägsnandet av överskott av konjugat bestäms bärarens enzymatiska aktivitet, vilket är proportionellt mot den initiala koncentrationen av antigenet som studeras. Den enzymatiska reaktionen (färgreaktionen) äger rum i närvaro av väteperoxid och ett substrat representerat av en ofärgad förening, som oxideras under peroxidasreaktionen till en färgad reaktionsprodukt i slutskedet av studien. Intensiteten av färgningen beror på mängden specifika antikroppar som detekteras.
Resultatet utvärderas spektrofotometriskt eller visuellt.
Kort schema: Antikropp → (Antigen) → Antikropp-K
Vid identifieringen av ett specifikt immunkomplex är antigenet så att säga inklämt mellan molekylerna av immobiliserade och märkta antikroppar, vilket var anledningen till den utbredda användningen av namnet "sandwich"-metoden . Testsystem för att detektera antikroppar fungerar på liknande sätt, men de använder ett antigen som immunosorbent, och konjugatet innehåller en lösning av ett antigen märkt med ett enzym.
"Smörgås"-metoden kan användas för att analysera endast de antigener på ytan av vilka det finns åtminstone två spatialt avlägsna antigena determinanter. Ett stort antal testsystem för enzymimmunanalys för olika infektioner är baserade på detta format: HIV-infektion , viral hepatit , cytomegalovirus , herpes , toxoplasma och andra infektioner.
För närvarande har testsystem som använder streptavidin och biotinylerade monoklonala antikroppar (som är en blandning av högt renade specifika monoklonala antikroppar mot olika epitoper) blivit utbredda. Standarder, kontroller och patientprover läggs till streptavidinbelagda mikrobrunnar, följt av biotinylerade antikroppar och konjugat. Efter blandning resulterar reaktionen i bildandet av ett "sandwich"-komplex, som binder till streptavidin i cellerna. Obundna komponenter avlägsnas genom tvättning. Efter inkubation med substratlösningen bestäms den optiska densiteten för lösningarna i brunnarna fotometriskt. En egenskap hos sådana system är avståndet för den enzymatiska reaktionen från plattans vägg, så färgen utvecklas i volym och testsystemet blir analytiskt känsligare. [3]
Konkurrenskraftiga ELISA-metoderOm i det första steget i systemet både analyten och dess analog (en enzymmärkt analyt eller en analyt immobiliserad på den fasta fasen) samtidigt är närvarande i systemet och konkurrerar om ett begränsat antal specifika bindningsställen, så är metoden konkurrenskraftiga . Denna typ av analys används ofta för att detektera antigener som är närvarande i höga koncentrationer eller hormoner som bara har ett antigenbindande ställe.
Den kompetitiva ELISA-metoden är uppdelad i flera typer: beroende på typ av detektion (direkt eller indirekt) och enligt typ av substans som är immobiliserad på den fasta fasen (antigen eller antikropp).
Direkt konkurrenskraftig ELISAAnvänds för att detektera ett antigen eller antikropp. Om ett antigen detekteras, använder det direkt kompetitiva ELISA-formatet specifika antigener immobiliserade på den fasta fasen. När testprovet och konjugatet introduceras, tävlar det senare om bindning med antigenerna som finns i provet (upplösta) och med immobiliserade antigener.
Analysstruktur.
Testprovet (humant serum eller plasma) och konjugatet tillsätts till brunnen i tabletten, på vars yta antigenerna adsorberas. Efter inkubation bildas två typer av immunkomplex: associerade och inte associerade med konjugatet, dvs innehåller en enzymmärkning (märkt) och utan den (omärkt). Tabletten tvättas. Ju fler omärkta antikroppar som finns kvar i brunnen, desto större blir konkurrensen med antikropparna i testprovet.
Vidare, efter tvättning av bäraren från obundna komponenter, tillsätts ett substrat-kromogent reagens och den enzymatiska aktiviteten hos de specifika immunkomplex som bildas på den fasta fasen registreras. [3]
Kort schema: Antigen → (Antigen) + Antikropp-K
Således är storleken på den detekterade signalen som erhålls genom direkt kompetitiv ELISA omvänt relaterad till antigenkoncentrationen.
För att detektera antikroppar utförs en liknande version av direkt kompetitiv ELISA med en antikropp immobiliserad på den fasta fasen.
Fördelen med direktschemat är ett litet antal steg, vilket gör det enkelt att automatisera analysen. Nackdelarna med schemat inkluderar komplexiteten hos metoder för syntes av enzymkonjugat, såväl som den möjliga inverkan av provkomponenter på enzymets aktivitet.
Indirekt (indirekt) kompetitiv ELISAAnvänds för att bestämma antigenet. I likhet med den direkt konkurrerande metoden immobiliseras antigenet också på den fasta fasen, men istället för konjugatet till antigenet används märkta märkta anti-antikroppsantikroppar (sekundära antikroppar). Antikroppar tillsätts till provet som tävlar om bindning antingen med antigenet från testpersonens blodserum (fritt, avlägsnat genom tvättning), eller med antigenet immobiliserat på den fasta fasen (ej avlägsnat genom tvättning). Därefter fästs ett konjugat av märkta antikroppar till de bundna antikropparna och den optiska densiteten bestäms. Det vill säga, om det inte finns någon mätbar substans i det införda provet alls, kommer alla antikroppar att binda till antigenet som immobiliseras genom bärarproteinet på ytan av brunnen, de kommer att stanna kvar i brunnen under tvättning och den detekterade signalen kommer att vara hög. Om det finns mycket av den uppmätta substansen i testpersonens serum (det vill säga det kommer att vara i lösning i fritt tillstånd), kommer en del av antikropparna att binda till denna substans och en del till den immobiliserade; antikroppar som är i fritt tillstånd (bundna till antigenet från serumet) kommer att avlägsnas genom tvättning, och den detekterade signalen kommer att ge antikroppar bundna till antigenet som är immobiliserat i brunnen - det kommer att vara lågt, eftersom en del av antikropparna togs bort genom att tvätta.
Analysstruktur.
Ett antigen -protein immobiliseras på ytan av bäraren , till vilken en lösning innehållande antigenet som ska bestämmas och en fixerad koncentration av omärkta specifika antikroppar tillsätts och inkuberas.
Efter avlägsnande av obundna komponenter tillsätts en fixerad koncentration av konjugatet (i detta fall märkta sekundära anti-artantikroppar).
Efter inkubation och tvättning av bäraren detekteras den enzymatiska aktiviteten hos de specifika immunkomplex som bildas på den fasta fasen.
Kort schema: Antigen → (Antigen) + Antikropp → Antikropp-K
Värdet på den detekterade signalen, såväl som vid användning av den direkta kompetitiva metoden, är omvänt proportionell mot koncentrationen av det detekterade antigenet .
Användningen av ett universellt reagens - märkta anti-artantikroppar - gör det möjligt att detektera antikroppar mot olika antigener. Dessutom införs det analyserade provet och det märkta reagenset i systemet i olika stadier, vilket eliminerar inverkan av olika effektorer som finns i provet på enzymmärkningens katalytiska egenskaper. Ett sådant analysschema komplicerar emellertid dess genomförande på grund av införandet av ytterligare steg. Denna metod används för kvalitativ och kvantitativ detektion av till exempel opiater (morfin, heroin), cannabinoider (marijuana, hasch), amfetamin och metamfetamin, barbiturater. [fyra]
Homogen ELISA
1972 utvecklade Rubenshetein och medarbetare ett nytt tillvägagångssätt för att köra hela analysen utan en fast fas. Metoden kallades homogen ELISA (eng. "EMIT" - enzym multiplied immunoassay technique) och baserades på skillnader i de katalytiska egenskaperna hos enzymmärkningen i fri form och i det immunkemiska komplexet. Dess essens ligger i bindningen av ett antigen med låg molekylvikt till enzymet lysozym nära det aktiva centret. I komplex med antikroppar blir enzymets aktiva centrum steriskt otillgängligt för det makromolekylära substratet, som är bakteriecellers väggar. Med en ökning av koncentrationen av det bestämda antigenet minskar koncentrationen av det inaktiva komplexet av konjugatet med antikroppar, och följaktligen ökar den registrerade parametern för den enzymatiska reaktionen. Baserat på detta tillvägagångssätt utvecklades kit för bestämning av ett brett utbud av giftiga, narkotiska och medicinska läkemedel. En väsentlig fördel med EMIT-analys är möjligheten att använda små volymer av det analyserade provet (5–50 μl) och den höga detektionshastigheten (2–5 min), på grund av frånvaron av ett separationssteg mellan fri och märkt analyt. Nackdelarna med metoden inkluderar lägre känslighet än vid heterogen ELISA (~ 1 μg/ml), och möjligheten att endast bestämma lågmolekylära antigener. [ett]
Funktioner och problem med ELISA
Liksom alla immunkemiska analysmetoder kan ELISA ge falskt positiva och falskt negativa resultat. Till exempel kan falska positiva resultat vid bestämning av antikroppar mot olika infektioner uppstå på grund av reumatoid faktor , vilket är immunglobulin M mot en persons egna immunglobuliner G; på grund av antikroppar som bildas i olika systemiska sjukdomar, metabola störningar eller ta mediciner; hos nyfödda kan sådana falska positiva reaktioner uppstå på grund av bildandet i barnets kropp av M-antikroppar mot moderns immunglobulin G. Dessutom kan polyklonalt aktiveringssyndrom vara orsaken till falskt positiva resultat. Samtidigt stimulerar speciella ämnen - superantigener - icke-specifikt produktionen av antikroppar mot olika infektioner av B-lymfocyter. I praktiken uttrycks detta i en ospecifik ökning av antikroppstiter mot många patogener samtidigt. [5] Falskt negativa resultat vid bestämning av antikroppar kan bero på immunbristtillstånd, såväl som tekniska fel i reaktionens formulering.
På grund av de otvivelaktiga fördelarna med enzymimmunanalys: användarvänlighet, hastighet, objektivitet på grund av automatisering av inspelningsresultat, möjligheten att studera immunglobuliner av olika klasser (vilket är viktigt för tidig diagnos av sjukdomar och deras prognos), är det sålunda för närvarande en av de viktigaste metoderna för laboratoriediagnostik.
De huvudsakliga typerna av testsystem beroende på vilka antigener som används
Beroende på vilka antigener som används delas ELISA-testsystem in i:
- Lysat - som använder en blandning av naturliga antigener (lyserat eller sonikerat smittämne erhållet i kultur);
- Rekombinant - där genetiskt modifierade proteiner används - analoger av vissa proteinantigener hos patogenen;
- Peptid - använder kemiskt syntetiserade fragment av proteiner.
Den allmänna utvecklingsriktningen för ELISA-diagnostik är riktningen från lysattestsystem, som vanligtvis kallas första generationens testsystem, till rekombinanta och peptidiska.
Tekniken för att erhålla rekombinanta proteiner gör det möjligt att i ganska ren form erhålla en analog av nästan vilket individuellt antigen som helst.
För att skapa ett högkvalitativt rekombinant testsystem är det nödvändigt att välja antigener från hela den antigena varianten av patogenen som skulle vara immunogena (det vill säga antikroppar mot dessa antigener bör produceras i en infekterad persons kropp) och mycket specifika (det vill säga karakteristisk endast för denna patogen och, enligt möjligheter som inte ger korsreaktioner med antikroppar mot andra antigener).
Dessutom är kvaliteten på reningen av rekombinanta proteiner av stor betydelse. I det ideala fallet är det möjligt att få ett rekombinant testsystem med nästan 100 % specificitet och hög sensitivitet.
I praktiken är detta inte alltid möjligt att uppnå, men specificiteten hos de bästa rekombinanta testsystemen närmar sig 100 %. För närvarande, på basis av peptidenzymimmunanalys, kan det sägas att kvantiferontestet för snabb och högprecisionsdiagnos av tuberkulos har implementerats framgångsrikt.
Perspektiv och utveckling av metoden
En av de viktiga uppgifterna är att hitta tillvägagångssätt som avsevärt kan minska analystiden med bibehållen hög känslighet. Ett av dessa tillvägagångssätt är överföringen av analys till den kinetiska regimen, som realiseras genom skapandet av automatiska enheter baserade på reaktionen i flödessystem.
Användningen av monoklonala antikroppar , strikt specifika för ett visst antigeniskt ställe av den analyserade föreningen, öppnar stora möjligheter . Genom att välja de lämpliga antikropparna är det möjligt att skapa ganska komplexa immunokemiska system som gör det möjligt att identifiera föreningar av de mest varierande intervallen.
ELISA-metoden är i ständig utveckling. Å ena sidan ökar antalet forskningsobjekt, å andra sidan fördjupas och förbättras själva analysmetoderna. Detta leder till det faktum att analysschemat förenklas, tiden för dess implementering reduceras och förbrukningen av reagens minskar. Det finns ett ständigt sökande efter fler och fler nya enzymer som används som markörer. Kemin hos makromolekylära föreningar, cell- och genteknik, under vilken tekniken för att erhålla reagenser för ELISA förändras, har ett ständigt ökande inflytande på ELISA. [1] Så om det innan införandet av genteknikmetoder var nödvändigt att isolera antikroppar från biologiska medier (och bra rening kräver betydande kostnader och tid, samt reagens och utrustnings livslängd), så är det för närvarande möjligt att använda insektsceller ( syrsa, cikada, kackerlacka) eller E. coli för att producera det önskade rekombinanta proteinet, som, samtidigt som det bibehåller de önskade biologiska egenskaperna, också är relativt rent, så att det är mycket lättare att isolera från blandningen och lagra i en stabiliserande lösning.
Anteckningar
- ↑ 1 2 3 4 A.M. Egorov, A.P. Osipov, B.B. Dzantiev, E.M. Gavrilov. [http://www.booksshare.net/index.php?id1=4&category=biol&author=egorov-am&book=1991 Teori och praktik för enzymimmunanalys ]. - M . : Förlag "Högskolan", 1991. - S. 3 -42. — ISBN 5-06-000644-1 .
- ↑ 1 2 www.polismed.com . Hämtad 12 april 2017. Arkiverad från originalet 13 april 2017.
- ↑ 1 2 3 4 5 Immunokemisk analys i laboratoriemedicin / V. V. Dolgov. - M.-Tver: LLC "Publishing house" Triada "", 2015. - S. 34-38. — ISBN 978-5-94789-695-4 .
- ↑ www.monographies.ru
- ↑ Polyklonalt aktiveringssyndrom som en orsak till falskt positiva ELISA-resultat (otillgänglig länk)
| Personlig medicin | |
|---|---|
| Omix datasektioner | |
| Applikationssektioner | |
| Metoder | |
| Relaterade artiklar | |