Det artificiella genomet är en riktning inom biologisk forskning kopplad till genetisk modifiering av befintliga organismer för att skapa organismer med nya egenskaper. Till skillnad från genteknik består ett artificiellt genom av kemiskt syntetiserade gener.
Det antas att artificiella genom i framtiden kan skapas som inte är baserade på DNA eller med hjälp av en annan uppsättning nukleotider och andra kodningsprinciper än i naturliga genom. Således är skapandet av artificiella genom ett av områdena för syntetisk biologi .
Det bör förstås att medan vi talar om syntesen av gener med naturliga genetiska koder eller deras små modifieringar . Det är möjligt att syntetisera en artificiell gen som kodar för vilken förutbestämd polypeptid som helst , men det är fortfarande omöjligt att designa en i grunden ny polypeptid så att den åtminstone vikas till en proteinkula , för att inte tala om att det resulterande proteinet börjar fungera som ett enzym .
För närvarande är den högsta prestationen inom området för att skapa ett artificiellt genom syntesen av kromosomen av bakterien Mycoplasma mycoides , utförd av Craig Venter 2010.
2010, personalen på Craig Venter Institutelyckats på konstgjord väg syntetisera den cykliska kromosomen av bakterien Mycoplasma mycoides med en storlek på 1 077 947 nukleotidpar [1] . Kromosomen implanterades i en cell av bakterien Mycoplasma capricolum , efter vars delning en cell bildades, helt kontrollerad av ett artificiellt genom.
Detta artificiella genom är nu känt under kodbeteckningen JCVI-syn1.0. Den upprepar nästan helt genomet från en av stammarna av bakterien Mycoplasma mycoides , med undantag för flera artificiellt införda genetiska markörer ( engelska watermark, watermarks ), flera obetydliga gener som tagits bort under syntesen och 19 mutationer som uppstod under monteringen av DNA- fragment . Celler med ett artificiellt genom fungerar normalt och är kapabla till flera divisioner.
Arbetet med det artificiella genomet började med arbetet av Frederick Sanger och hans medarbetare, som 1977 lyckades fastställa den fullständiga nukleotidsekvensen av bakteriofagens φX174-genom med en längd på 5375 nukleotidpar [2] . Arton år senare, 1995, sekvenserade Craig Venters grupp för första gången genomet av en självreplikerande organism, den 1 830 137-par bakterien Haemophilus influenzae [3] .
Under de senaste 25 åren (1985-2010) har graden av genomsekvensering ökat med minst 8 storleksordningar. Explosionen av antalet organismer vars genom har avlästs har gett upphov till problemet att förstå varje gens biologiska roll i en organism. Fram till nyligen var det inte klart om arvsmassan innehåller fullständig information om organismens struktur, och om en organism med ett kemiskt syntetiserat genom skulle vara livsdugligt. En annan fråga som molekylärbiologin stod inför var om bakteriernas genom är det minsta nödvändiga och vad är den minsta uppsättning gener som kan skapa en levande cell.
År 1996 föreslog Arkady Mushegyan och Evgeny Kunin ( National Center for Biotechnology Information , USA ) att de 256 ortologa generna som delas av den gramnegativa bakterien Haemophilus influenzae och den grampositiva bakterien Mycoplasma genitalium är en bra approximation till minimiuppsättningen av bakterier cellgener [4] . År 2004 föreslog en grupp forskare från University of Valencia ( Spanien ) en uppsättning av 206 proteinkodande gener erhållna från analys av flera bakteriegenom [5] .
Forskare från Craig Venters grupp har skapat en organism med ett minimalt artificiellt syntetiserat genom sedan 1995 [1] . År 1995 sekvenserade de genomet av Mycoplasma genitalium , det orsakande medlet för sjukdomar i det mänskliga genitourinary systemet, den minsta organism som är känd hittills som kan reproducera sig själv. Denna mikroorganism innehåller 517 gener, varav 482 kodar för proteiner . Den totala volymen av genomet är 580 tusen nukleotidpar. 1999 , genom att analysera platsen för transposoner i sekvenserade genomer, var det möjligt att fastställa att från 265 till 350 gener är avgörande för en organism, och mer än 100 gener har ett okänt syfte [6] . Ytterligare forskning 2005 utökade listan över vitala gener till 382 [7] .
Senare upptäcktes även mindre prokaryota genom, men de tillhör alla obligatoriska symbionter - organismer som inte kan existera autonomt.
År 2003 sekvenserades genomet av Nanoarchaeum equitans med 490 885 par [8] . Det har också fastställts att det osekvenserade genomet av Buchnera -arten har en längd på cirka 450 tusen par [9] .
Det minsta av bakteriegenomet som hittills avkodats är genomet från den intracellulära endosymbionten av bakterien Carsonella , bestående av 159 662 nukleotidpar och innehåller endast 182 proteinkodande gener. Detta genom sekvenserades av japanska forskare 2006 [10] .
Craig Venters grupp utvecklade en teknik för syntes av stora DNA- molekyler baserad på kemiskt syntetiserade fragment av 5-7 tusen par stora, kallade kassetter . Fragmenten sammansattes dels in vitro med lämpliga enzymer , dels genom in vivo rekombination i jästcellen Saccharomyces cerevisiae . Det fullständiga syntetiska genomet har framgångsrikt klonats som en centromer plasmid (YCp) i jästceller [11] .
Det första försöket att skapa ett artificiellt genom, som gjordes 2008, bestod i syntesen av en Mycoplasma genitalium -kromosom 582 970 par lång. Överlappande kassetter med en storlek på 5–7 tusen par, sammansatta av kemiskt syntetiserade polynukleotider, kombinerades sekventiellt med hjälp av enzymer till fragment av 24, 72 och 144 tusen par stora (1/24, 1/8 och 1/ 4 av genomet). Den fullständiga sammansättningen av genomet från fyra komponenter utfördes genom rekombination i Saccharomyces cerevisiae -cellen . Sekvensering av den resulterande kromosomen bekräftade syntesens noggrannhet. Bakterien M. genitalium underart G37 (prov MG408) användes som en prototyp, vars patogena aktivitet blockerades av en speciell markör. För att identifiera det artificiella genomet introducerades nukleotidsekvenser som kallas "vattenmärken" i DNA [ 11 ] .
Vissa svårigheter uppstod under överföringen av en syntetisk kromosom från en donatorcell (jäst) till en mottagarcell. Ett separat problem var avlägsnandet av det ursprungliga genomet från bakteriecellen för att ersätta det med ett syntetiskt.
I ytterligare experiment var M. genitalium- bakterier tvungna att överges som en genetisk prototyp på grund av deras extremt låga tillväxthastighet. I studier som genomfördes 2010 användes genomet av Mycoplasma mycoides subsp. capri ( GM12 ) som en prototyp, och Mycoplasma capricolum subsp . capricolum (CK) användes som mottagare .
För att utveckla tekniken för att överföra kromosomer från en jästcell till en mottagarcell har metoder utvecklats för att klona hela kromosomer i form av jästcentromera plasmider. Den naturliga kromosomen av M. mycoides användes som föremål för experiment . De första försöken att överföra M. mycoides- kromosomen till M. capricolum -cellen slutade dock i misslyckande. Som det visade sig låg problemet i bakteriecellsrestriktionssystemet . Restriktionssystemen för M. mycoides och M. capricolum är desamma, deras DNA är metylerat och det finns inga problem med direkt överföring av en kromosom från en cell till en annan [12] . DNA som klonas i jäst metyleras inte och, när det överförs till M. capricolum , förstörs det av restriktionssystemet. För att undvika detta metylerades donator-DNA med renat metylas eller ett extrakt från M. mycoides eller M. capricolum , eller så förstördes mottagarcellens restriktionssystem helt enkelt [13] .
Det andra försöket att syntetisera bakteriegenomet gjordes 2010. Kromosomen av bakterien Mycoplasma mycoides (underart capri GM12) med en volym på 1,08 miljoner nukleotidpar valdes som prototyp . Detta artificiella genom fick kodnamnet JCVI-syn1.0. Två genom användes för arbetet: CP001621 [14] ( GenBank databas ), sekvenserad av gruppen J. Glass från Craig Venter Institute 2007 [12] , och det transgena genomet CP001668 [15] , sekvenserat av gruppen av Carol Lartik 2009 [13] . Baserat på prov CP001621 syntetiserades kassetter och användes för vidare syntes. I slutet av sekvenseringen av prov CP001668 utfördes en avstämning, som fann skillnader i 95 fragment. Skillnader som visade sig vara biologiskt signifikanta korrigerades för redan syntetiserade kassetter. 19 skillnader som inte påverkar bakteriens vitala aktivitet lämnades oförändrade. I fyra regioner av genomet som inte är vitala bildas 4 WM1-WM4-taggar med en längd på 1246, 1081, 1109 respektive 1222 par. Den resulterande M. mycoides JCVI syn1.0-gensekvensen matades in i GenBank-databasen under koden CP002027 [16] .
| Bioteknik | |
|---|---|
| Områden för bioteknik | |
| Relaterade artiklar |
|
| Forskare | |
| Popularisatorer | |