Nukleosompositionering är bestämningen av nukleosomernas position på eukaryota DNA- sekvenser. DNA-segment kan antingen vara en del av nukleosomala komplex eller vara en del av linker, internukleosomalt DNA. Denna egenskap hos DNA bestämmer dess tillgänglighet för interaktion med proteiner .
Utvecklingen av metoder för positionering av nukleosomer går tillbaka till 1973, då egenskapen hos nukleärt kromatin , under verkan av endogena nukleaser , visade sig delas upp i en serie individuella DNA-fragment av ungefär lika långa. Inledningsvis, i experiment, användes deoxiribonukleas I som ett nukleas; därefter blev mikrokockernukleas utbrett [1] .
En experimentell metod för att bestämma de DNA-regioner som utgör nukleosomer är baserad på användningen av mikrokockernukleas (MNase-seq-metoden). Celler fryses och krossas, får tina. Efter upptining behandlas det kromatinhaltiga homogenatet med mikrokockernukleas. Nukleaset klyver länkområdena av DNA som inte är skyddade av nukleosomer. Med hjälp av proteaser och RNaser renas lösningen från proteiner och RNA . DNA extraheras från lösningen. Det används både kolonnkromatografi och vätskeextraktion alternativ - fenol-kloroformextraktion [2] .
DNA fälls ut med etanol . Inte alla länkställen kunde klyvas av nukleas. I detta skede består DNA-produkten av en blandning av DNA-fragment motsvarande regioner med olika nukleosomtäckning. DNA - fragmenten separeras efter storlek genom agarosgelelektrofores . DNA extraheras från gelremsan som innehåller mononukleosomprodukten. De resulterande DNA-fragmenten förbereds för sekvensering . Användningen av högeffektiv SOLiD- teknik är utbredd . Som ett resultat av sekvensering erhålls ett bibliotek av Fragmenten kartläggs till genomet . Täckningen av olika delar av genomet används för att bedöma lokaliseringen av nukleosomer enligt DNA-sekvensen [3] [4] .
Användningen av mikrokocknukleas beror på det faktum att det har både endonukleas- och exonukleasaktiviteter . Nukleaset skär DNA och klyver sekventiellt bort nukleotider från de fria ändarna. Nackdelen med mikrokocknukleas är dess preferens, som endonukleas, för ställen sammansatta av alternerande nukleotider dA och dT efter dC eller dG . Samtidigt känner den dåligt igen platser från endast upprepade dA eller dT (4–6). Som ett exonukleas klyver mikrokocknukleas nukleotiderna dC och dG långsammare. Enzymets arbete är starkt hämmat i de regioner av DNA som interagerar med proteiner. Med en lång exponeringstid börjar nukleaset även klyva nukleosomalt DNA, främst på platser nära nukleosomens yta. Enzymets arbete i experimentet stoppas genom att tillsätta en EDTA- lösning [5] .
MNase-seq-metoden kan kompletteras med ultraljudsavbrott och/eller histon H3-immunutfällning (ChIP-seq), såväl som användning av enzymer som DNase (DNase-seq), transposas (ATAC-seq) och CpG [ -metyltransferas (NOME-seq). Direkt kemisk förstörelse av DNA mellan nukleosomer kan användas, till exempel genom att använda en hydroxylradikal eller små aromatiska molekyler som metidiumpropyl-EDTA, som förs in i DNA-dubbelhelixen huvudsakligen i regionerna mellan nukleosomer och förstör den i närvaro av Fe 2+ katjoner (MRE-metod -seq) [6] .
När man studerar olika faktorer som påverkar fördelningen av nukleosomer över DNA försöker man vanligtvis isolera själva nukleotidsekvensens påverkan. För att göra detta sätts DNA-komplexet med histonproteiner ihop in vitro från DNA och histonoktamerer som tidigare renats från proteiner . Mängden DNA och histoner tas i ett visst förhållande, ungefär en histonoktamer per 850 baspar . Därefter utförs samma manipulationer som i den vanliga metoden med användning av mikrokockernukleas [3] .
För närvarande utvecklas metoder för positionering av nukleosomer med hjälp av bioinformatiska metoder . Grunden för metoderna är de experimentellt avslöjade regelbundenheterna i fördelningen av nukleosomer i olika regioner av genomet, och beroendet av dessa fördelningar på sekvensen av DNA-nukleotider [7] . Data om resultaten av experimentell kartläggning av nukleosomer samlas in i NPRD- databasen ( Eng. Nucleosome Positioning Region Database ) [8] .