Tunnskiktskromatografi

Tunnskiktskromatografi är en kromatografisk metod där ett tunt skikt av adsorbent används som en stationär fas . Metoden bygger på att de ämnen som ska separeras är olika fördelade mellan det sorberande skiktet och eluenten som strömmar genom det , vilket gör att det avstånd med vilket dessa ämnen samtidigt förskjuts längs skiktet varierar. Tunnskiktskromatografi ger stora möjligheter för analys och separation av ämnen, eftersom både sorbenten och eluenten kan variera över ett brett intervall. Plattor med olika sorbenter finns kommersiellt tillgängliga, vilket gör det möjligt att använda metoden snabbt och rutinmässigt. En variant av tunnskiktskromatografi är mer tillförlitlig och reproducerbar.högpresterande tunnskiktskromatografi , som använder speciella plattor och sofistikerad utrustning.

Tunnskiktskromatografi upptäcktes 1889, utvecklades avsevärt i mitten av 1900-talet och används fortfarande i stor utsträckning inom läkemedels-, medicin-, livsmedelsområdet, såväl som inom akademisk och industriell vetenskap.

Historik

Förutsättningen för skapandet av metoden var användningen av papperskromatografi av Schönbein 1861 [1] . Denna metod utvecklades i verk av Goppelsreder, en elev av Schönbein, på 80-talet av XIX-talet [2] . Tekniken på den tiden kallades kapilläranalys. Verket var så gott som bortglömt och 1944 återupptäcktes cellulosakromatografi av Consden et al. Tunnskiktskromatografimetoden, nästan i den form som den nu är känd, användes första gången av den holländska biologen Martin Beijerinck 1889. När han studerade diffusionen av svavelsyra och saltsyra i gelatin fann Beyerink att saltsyra rörde sig snabbare än svavelsyra. I sina experiment upptäckte han saltsyrazonen genom att tillsätta en silverkloridlösning till skiktet och svavelsyrazonen genom att tillsätta en bariumkloridlösning . 1898 tillämpade Wijsman en liknande metod för bestämning av enzymer i maltdiastas och var den första som använde fluorescerande detektion; metodens känslighet vid den tiden gjorde det möjligt att fastställa förekomsten av ett ämne i mängden 40 pg [3] . Trots detta användes faktiskt inte både kolonnkromatografi, utvecklad av M. S. Tsvet i början av 1900-talet, och tunnskiktskromatografi förrän på 1930-talet [4] .

1938 rapporterade Izmailov och Schreiber att de utförde cirkulär kromatografi på ett lager av aluminiumoxid avsatt på en glasplatta. I det här fallet tog skikten av separerade ämnen formen av koncentriska cirklar. Forskare har visat att metoden kan användas för att testa sorbenter och eluenter för kolonnkromatografi [3] .

Betydande framsteg i utvecklingen av TLC-metoden uppnåddes av J. Kirchner och medarbetare, som 1945-1954 arbetade med isolering av luktämnen från citrusfrukter genom kromatografiska metoder. Övertygade om papperskromatografins otillämplighet för deras syften, utvecklade de en metod som kombinerade fördelarna med pappers- och kolonnkromatografi, men den väckte inte mycket uppmärksamhet förrän den annonserades av Desaga och Merck [3] .

Fram till mitten av 1950-talet användes termerna "bandkromatografi", "plåtkromatografi", "tunnfilmskromatografi", "öppen kolonnkromatografi" för att beskriva metoden, men termen "tunnskiktskromatografi", som föreslogs av E. Stahl 1956 [5] visade sig vara så framgångsrik att den ersatte alla andra. Ungefär samtidigt pekade den auktoritativa tidskriften Chemical Abstracts ut publikationer om detta ämne som ett separat index, och erkände det som en oberoende metod för analytisk kemi [3] .

Stationär fas

Tallrikar med ett applicerat adsorptionsskikt dök upp till försäljning 1961 och har nu praktiskt taget tagit hemgjorda ur bruk. Sorbenter med en partikelstorlek på 10–20 µm appliceras på ett substrat, vanligtvis tillverkat av glas , plast eller aluminium . Skikttjockleken sträcker sig från 100-250 µm (för analytiska plattor) till 2 mm (för preparativa plattor). Standardplåtformatet är 20x20 cm, men det finns även formaten 10x20, 5x20 och 2,5x5 cm Du kan själv skära en plåt i önskad storlek. Plattor finns också tillgängliga med kanaler för att underlätta provapplicering och förhindra provblandning. Plattor med ett föradsorptionsskikt är gjorda av ett material med lägre adsorberande kapacitet ( cellulosa , kiselgur ). Sådana lager tjänar till att rengöra provet, samt att bilda en smal remsa innan provet når det separerande lagret [6] .

Plattor för TLC med hög genomströmning föreslogs 1975 och har även dimensionerna 10×20 och 10×10 cm med en adsorptionsskikttjocklek på 200 µm. Sådana plattor har ökad upplösning, lägre detektionsgräns och kräver mindre lösningsmedel för eluering. 1995 dök förbättrade högpresterande sfäriska partikelplattor upp. 2001 erbjöds plåtar med ett monolitiskt lager på marknaden, som endast användes i vetenskaplig forskning [6] .

Flera material har historiskt använts som adsorbenter: aluminiumoxid (surt, neutralt och basiskt), kiselgur (renad kiselgur), polyamider , katjonbytarhartser . Dessa material nämns fortfarande i läroböcker och vetenskapliga artiklar idag, men de har förlorat sin betydelse, och deras produktion har i princip stoppats [6] .

Ett bindemedel kan användas för att stärka plattorna. Tidigare, för dessa ändamål, till exempel i plattor med silikagel G, användes gips i stor utsträckning i mängden 13 massprocent. Dagens kommersiellt tillgängliga register använder organiska bindemedel (t.ex. metakrylater). Användningen av stärkelse och karboximetylcellulosa beskrivs också i litteraturen . Faktum är att bindemedlet är en komponent i den stationära fasen, så att använda olika bindemedel kan leda till olika kromatografiska resultat [6] .

För att göra bestämningen av positionerna för ämnens zoner mer bekväm kan en fluorescerande indikator införas i adsorptionsskiktet. När ett sådant skikt bestrålas med ultraviolett strålning med en våglängd på 254 nm ger det ett grönt (F 254 ) eller ljusblått (F 254 s ) sken. I detta fall ser den zon av ämnet som absorberar ultraviolett ljus mörk ut mot bakgrunden av det fluorescerande lagret [6] .

Kiselgel

Ett av de viktigaste materialen i stationär fas är silikagel, som används i mer än 90 % av tunnskiktskromatografiapplikationer. Kiselgel erhålls genom sur utfällning från silikatlösningar eller genom hydrolys av kiselderivat . Diametern på de resulterande partiklarna beror på förhållandena, till exempel gör en förändring av pH -värdet det möjligt att erhålla silikagel med en yta på 200 till 800 m²/g. Ur kemisk synvinkel innehåller ytan på silikagel siloxan (Si-O-Si) och silanolgrupper (Si-OH). Silanolgrupper kan vara fria, vicinala eller geminala. De kan också interagera med varandra genom bildandet av vätebindningar [6] .

Således kännetecknas silikagel av många variabla parametrar, vars kontroll kan vara olika för olika tillverkare. Trots det har metoder utvecklats som gör det möjligt att erhålla sfärisk silikagel med en given porstorlek. Många kvaliteter har en porstorlek på 60 Å och kallas "silicagel 60" [6] .

Kiselgel har mycket hög affinitet för vatten och etablerar snabbt jämvikt med det, så resultatet som erhålls under TLC kan till viss del bero på luftfuktigheten i rummet [6] .

Aluminiumoxid

Aluminiumoxid är en polär oorganisk hydrofil sorbent. Det erhålls genom att termiskt avlägsna vatten från hydratiserad aluminiumhydroxid . Aluminiumoxid för kromatografi värms vanligtvis till en låg temperatur, vilket ger ett material med en specifik yta på 50-250 m2/g. Det sorberade vattnet avlägsnas vid en temperatur på 250 °C [7] .

Modifierade stationära faser

Kiselgel kan modifieras genom tre typer av reaktioner: förestring , reaktion med klorsilan innehållande den önskade organiska substituenten, eller klorering följt av behandling med en organolitiumförening . Denna modifiering leder till bildandet av stationära faser med speciella egenskaper som beror på substituenternas natur och metoden för deras tillsats till silikagel [6] .

De  vanligaste är omvända faser ( RP ), där substituenten som införs i silikagel är en alkylkedja med en längd av 2 till 18 kolatomer. C2-faserna har ersatt teknikerna för impregnering av silikagel med paraffin eller silikonolja för efterföljande användning i omvänd faskromatografi. Kompletta omvända faser innehåller C8- eller C18-kedjor. Hydrofila faser innehåller aminogrupper , diolgrupper , nitrilgrupper på ytan och kan användas i både omvänd fas- och normalfaskromatografi. I normalfasläge har de lägre hållkapacitet och är okänsliga för fukt. Sådana faser har ofta en speciell selektivitet på grund av aminogruppernas basicitet eller hydroxylgruppernas surhet, vilket gör det möjligt att ändra ordningen för produktionen av komponenterna i den analyserade blandningen [6] .

Cellulosa

Den första formen av användning av cellulosa i tunnskiktskromatografi var papperskromatografi . Tillgängliga plattor för TLC och TLC med hög genomströmning tillåter separation av blandningar av polära ämnen, medan åtminstone ternära blandningar av vatten, ett organiskt lösningsmedel som är oblandbart med det och ett vattenlösligt lösningsmedel som främjar bildningen av en fas används som elueringsmedel [6] .

Beteckningar i namnen på kommersiellt tillgängliga TLC-plattor [8]
Minskning Menande
CHIR Kiralt skikt för att separera enantiomerer
CN Hydrofilt lager med cyanogrupper
DIOL Hydrofilt skikt med diolmodifiering
F Innehåller en fluorescerande indikator
F 254+366 Fluorescerande indikator excitationsvåglängder
F 254s Syrabeständig fluorescerande indikator
G Gips
H Innehåller inga modifieringar
NH2 _ Hydrofilt lager med aminogrupper
P För förberedande arbete
R Speciellt renad
RP omvänd fas
RP-8, RP-18 Omvänd fas med 8- eller 18-kolsdel
Silaniserad, RP-2 Omvänd fas med dimetylsilylmodifiering
W Vätt lager
40, 60,... Genomsnittlig porstorlek i ångström

Mobilfas

Den mobila fasen är ansvarig för att flytta provet genom kromatografisystemet, och att välja rätt är viktigt för optimala resultat. Som en mobil fas tillåter TLC användningen av både ett individuellt lösningsmedel och komplexa blandningar. Silikagelkromatografi använder vanligtvis blandningar av organiska lösningsmedel. Omvänd faskromatografi använder en blandning av vatten och ett organiskt lösningsmedel. I båda fallen kan den mobila fasen kännetecknas av två parametrar: lösningsmedlets styrka, som bestämmer graden av rörlighet hos provkomponenterna med avseende på sorbenten, och selektiviteten, som påverkar ordningen av ämnenas zoner. Minimikravet för den mobila fasen är åtminstone partiell löslighet av provet i den.

Styrkan hos lösningsmedlet

Lösningsmedlets styrka är en parameter som bestämmer den mobila fasens förmåga att föra ämnen genom sorbenten. Så ett svagt lösningsmedel kan inte flytta ämnets zon från appliceringspunkten, och ett starkt, tvärtom, förskjuter ämnets zon praktiskt taget med frontlinjen [9] . En lämplig eluent kommer att flytta materialet omkring 1/3 av den totala sträckan som eluenten tillryggalägger. När det gäller kiselgel är polära lösningsmedel starkare, och icke-polära är svagare (detta beroende skiljer sig för olika sorbenter) [10] .

En kvantitativ beskrivning av lösningsmedlets styrka ges av parametern E° , som kan definieras som lösningsmedlets adsorptionsenergi per enhet standardsorbent. I praktiken kan den sträcka som ett ämne tillryggaläggs inte beräknas utifrån denna parameter, men en relativ uppskattning är möjlig: med ett större värde på E° för eluenten färdas ämnet en längre sträcka, och vice versa. För omvända faser är situationen den motsatta. Substanszonens migrationsavstånd är också relaterat till dess polaritet: fler polära ämnen interagerar starkare med kiselgel och rör sig långsammare, medan opolära ämnen uppvisar svagare interaktioner och migrerar vidare [10] .

Ett lämpligt elueringsmedel bestäms experimentellt. Till exempel kan ett prov kromatograferas i etylacetat . Om styrkan på etylacetat är för hög måste man byta till ett mindre polärt lösningsmedel eller använda en blandning av etylacetat med ett mindre polärt lösningsmedel (som hexan ). Om styrkan på lösningsmedlet är för låg kan du experimentera med ett mer polärt lösningsmedel eller öka styrkan på etylacetat genom att tillsätta metanol [10] .

Lösningsmedelsstyrka parameter E° för olika lösningsmedel på aluminiumoxid [10]
Lösningsmedel E ° , Al2O3 _ Lösningsmedel E ° , Al2O3 _ Lösningsmedel E ° , Al2O3 _ Lösningsmedel E ° , Al2O3 _ Lösningsmedel E ° , Al2O3 _
Fluoroalkaner -0,25 Butylklorid 0,26 Dietylsulfid 0,38 Etylacetat 0,58 etanol 0,88
n- Pentan 0,00 xylen 0,26 Kloroform 0,40 Metylacetat 0,60 metanol 0,95
Hexan 0,00 Diisopropyleter 0,28 diklormetan 0,42 Amylalkohol 0,61 etylenglykol 1.11
Isooktan 0,01 2-kloropropan 0,29 Metylisobutylketon 0,43 Dimetylsulfoxid 0,62 Ättiksyra stor
Cyklohexan 0,04 Toluen 0,29 Tetrahydrofuran 0,45 Anilin 0,62 Vatten stor
Cyklopentan 0,05 1-kloropropan 0,30 Dikloretan 0,49 dietylamin 0,63 Salter och buffertar väldigt stor
Diisobutylen 0,06 Klorbensen 0,30 Metyletylketon 0,51 Nitrometan 0,64
Penten-1 0,08 Bensen 0,32 1-nitropropan 0,53 Acetonitril 0,65
koldisulfid 0,15 Brometan 0,37 Aceton 0,56 pyridin 0,71
Koltetraklorid 0,18 dietyleter 0,38 dioxan 0,56 propylalkoholer 0,82

Lösningsmedelskvalitet

Vid tunnskiktskromatografi kan kvaliteten på de använda lösningsmedlen spela en betydande roll. Det rekommenderas att använda lösningsmedel av åtminstone analytisk kvalitet, eftersom föroreningar som finns i eluenten kan interagera med sorbenten eller det lösta ämnet. Vissa lösningsmedel genomgår autooxidation under lagring. Lösningsmedel kan sönderdelas eller på annat sätt reagera när de förvaras i metallbehållare. Reproducerbarheten påverkas avsevärt av lösningsmedlets vattenhalt, vars mängd kan förändras över tiden, vilket leder till en förändring av elueringsmedlets styrka. Till exempel, förutom andra föroreningar, innehåller kloroform ofta etanol som stabilisator, varav även små mängder avsevärt kan påverka resultatet av kromatografi [10] .

Genomföra ett experiment

Provberedning

För korrekt provberedning måste en representativ del av materialet väljas. Detta kräver vanligtvis att det löses helt i ett lämpligt lösningsmedel. Ibland är det inte möjligt att lösa upp hela provet: i det här fallet är det nödvändigt att se till att åtminstone de nödvändiga ämnena är upplösta. Närvaron av en stor mängd föroreningar eller en matris i ett ämne kan försämra resultaten av en analys eller separation, så ett provreningssteg genom extraktionsmetoder kan tillämpas i förväg . Detta steg implementeras med hjälp av plattor med ett preadsorptionsskikt som fångar de polära komponenterna i matrisen [11] .

Jämfört med kolonnkromatografi är tunnskiktskromatografi mindre krävande på föroreningar, eftersom kolonner måste tvättas innan nya prover appliceras och TLC-plattor används endast en gång [11] .

Förberedelser för skivor

Ibland utsätts plattor för ytterligare beredningssteg innan TLC utförs [12] .

Tillämpning av provet

Appliceringen av provet på plattan påverkar avsevärt kvaliteten på resultatet. Således beror separationen av komponenterna i en blandning på storleken på den applicerade zonen i kromatografins riktning, och det är möjligt att jämföra prover med deras rörlighet endast om zonerna är korrekt applicerade på plattan. När man gör en kvantitativ analys är det nödvändigt att tillämpa noggrant uppmätta volymer av lösningar av ämnen [11] .

Det finns två sätt att tillämpa provet: manuellt och automatiskt. Vid manuell applicering markeras spetsar på plattan med en penna som ligger på ett segment parallellt med plattans nedre kant och på ett sådant avstånd från denna att spetsarna inte sjunker ner i eluenten. Antalet poäng ska vara lika med antalet analyserade prover. Därefter appliceras en lösning av det analyserade provet med hjälp av mikrokapillärer på de markerade punkterna, vars volym vanligtvis är begränsad till 5 μl vid TLC och 1 μl vid TLC med hög genomströmning. Stora volymer lösningar appliceras med flera beröringar och torkar lösningsmedelsplattan mellan dem. I det här fallet bör lösningsmedlet som provet finns i ha så liten polaritet som möjligt, eftersom cirkulär kromatografi sker under appliceringen, vilket kan leda till spridning och separation av provkomponenterna [11] .

Automatiska och halvautomatiska provappliceringssystem använder sprayprincipen. Lösningen dras in i sprutans nål, nålen placeras sedan exakt ovanför plattans yta och kolven pressar ut en given volym av lösningen. Lösningsmedlet avlägsnas genom blåsning med tryckluft eller kväve. Tekniken låter dig skapa smala zoner av ämnen, vilket bidrar till maximal upplösning. Applicering av ämnen är också möjlig i form av spetsar eller rektangulära zoner, och de applicerade volymerna kan variera från några nanoliter för TLC med hög genomströmning till hundratals mikroliter för preparativ TLC. I det senare fallet gör tekniken det möjligt att skapa en enhetlig långsträckt zon längs hela plattan [11] .

Eluering

Efter applicering av lösningen av den undersökta blandningen av substanser placeras plattan i ett kärl i vilket ett lager av elueringsmedel hälls i botten. När den nedre kanten av plattan är nedsänkt i vätska, börjar eluenten stiga upp i det kromatografiska skiktet under inverkan av kapillärkrafter . För att undvika avdunstning av det flyktiga elueringsmedlet från plattans yta under kromatografi, försluts kärlet. Efter att frontlinjen når en höjd som är tillräcklig för analys, tas plattan bort och torkas. Den sträcka som frontlinjen tillryggalagt räknas vanligtvis från startlinjen. Det är valt tillräckligt för efterföljande identifiering av de separerade ämnena på plattans yta. Separationen av blandningskomponenterna förbättras med att öka detta avstånd, men det finns ett optimalt värde, som för konventionella plattor är 12–15 cm.Detta beror på det faktum att kapillärkrafter verkar på de vätande frontlinjerna, och den mobila fasen är mindre och mindre påverkas när den rör sig genom det kromatografiska skiktet kapillärkrafter på grund av deras balanserande tyngdkraft.

Vid kromatografi tar det från 45 till 150 minuter att föra fram fronten till optimal längd, beroende på elueringsmedlets viskositet. Vid TLC med hög genomströmning är partikelpackningen i det kromatografiska skiktet tätare, det optimala avståndet är cirka 6 cm och elueringen tar från 15 till 50 minuter [13] .

Det finns olika sätt att eluera prover på plattor. Den vertikala plattan och stigande elueringsmetoden är den vanligaste och ger acceptabla resultat för de flesta ändamål. Det finns också kärl som gör att den mobila fasen kan riktas horisontellt. Resultaten i detta fall är jämförbara med de vanliga, men fördelen är att eluenten kan matas samtidigt i två motsatta riktningar, vilket gör det möjligt att fördubbla antalet prover (72 prover kan separeras samtidigt på en högpresterande 20×10 cm tallrik). Cirkulär och anticirkulär kromatografi, där eluentens förflyttning sker från centrum till periferin eller vice versa, används mycket begränsat, till exempel vid val av lösningsmedel för kromatografi [13] .

Multipel eluering används när en enda eluering inte effektivt separerar komponenterna i blandningen. Vid upprepad eluering i samma lösningsmedelssystem sker optimering på grund av koncentrationen av felaktigt applicerade zoner av ämnen. Det är också möjligt att föreluera i ett mycket polärt lösningsmedel under en kort tid, vilket gör att ämnena kan koncentreras på skiktet. Preliminär eluering i ett opolärt lösningsmedel gör att du kan ta bort den opolära matrisen från objektet [13] .

En tvådimensionell eluering innehåller två på varandra följande elueringar i vinkelräta riktningar. Efter den första elueringen avlägsnas plattan, torkas och linjen på vilken de separerade komponenterna är placerade blir startlinjen i den andra elueringen. I det här fallet kan du använda två eluenter av olika styrka, samt samma eluent, vilket är användbart för att bedöma stabiliteten hos ett ämne i ett kromatografiskt experiment [13] .

Visualisering

Efter eluering är de separerade ämnena i blandningen placerade på plattans yta i vissa positioner. Ett antal metoder har föreslagits för att bestämma deras positioner på plattan. Om ämnet är färgat bestäms fläckens position visuellt, ingen ytterligare bearbetning med reagens eller visualisering med andra metoder krävs. De flesta organiska föreningar är dock färglösa. Om ett ämne absorberas i det ultravioletta området, så visualiseras det på en platta med en fluorescerande indikator F 254 under ultraviolett strålning (fläckar av sådana ämnen på plattan ser antingen mörka eller fluorescerande ut) [14] .

Mer eller mindre selektiva kemiska avbildningsmetoder används i stor utsträckning. Till exempel är den enklaste metoden att behandla med jodånga , medan de sorberade ämnena blir mörkbruna och bakgrunden förblir ljus. Universella metoder är baserade på användningen av lösningar av olika syror eller oxidationsmedel , när de värms upp med vilka ämnen bildar bruna eller svarta fläckar. Selektiva reagens, såsom ninhydrin , gör det möjligt att visualisera föreningar av en specifik klass - aminer och aminosyror [14] .

Kromatografiska tunnskiktsplattor kan också användas i biologiska tester för att upptäcka ämnen med biologisk aktivitet mot mikroorganismer genom att så kulturer av mikroorganismer i ett näringsmedium på plattor [14] .

Utvärdering av resultat

En visuell jämförelse av rörligheten och naturen av visualisering (färg, fluorescens) av provet och vissa standarder ger information om analytens natur, och zonens intensitet kännetecknar dess mängd. Ämnen kan också tvättas bort från det kromatografiska skiktet för vidare analys med andra metoder. Kvantifiering i högpresterande TLC utförs på digitala bilder efter experimentet enligt standardiserade metoder. Scanning densitometri ger information om de spektrala egenskaperna hos ämnena på plattan. För att förbättra analysens noggrannhet används jämförelse av spektra med databasposter, samt masspektrometri av separerade ämnen. Kvantifiering utförs också med hjälp av en skanningsdensitometer [15] .

Teori om tunnskiktskromatografi

Lösningsmedelsflöde

Flödet av den mobila fasen genom skiktet vid tunnskiktskromatografi orsakas av inverkan av kapillärkrafter. Vätskefrontens rörelse kan beskrivas med ett kvadratiskt beroende:

där zf är avståndet från diplinjen  till frontlinjen, t  är elueringstiden och ϰ är flödeskonstanten eller hastighetsfaktorn. Detta förhållande etablerades 1856 av ingenjören Henri Darcy , som undersökte graden av penetration av jordvatten genom en porös yta. Ekvationen visar att den främre migrationshastigheten minskar hyperboliskt med ökande migrationsväg. Så, till exempel, vid ett givet värde på ϰ = 3,3 cm²/s, tar den främre migrationen med 10 cm 30 minuter och med 15 cm tar det 68 minuter [16] . Flödeskonstanten ϰ bestäms av sorbentpartiklarnas diameter, såväl som förhållandet mellan elueringsmedlets ytspänning och dess viskositet [17] . Vattnet som sorberas på skiktet binder ofta till skiktet starkare än komponenterna i eluenten. I detta fall minskar vatten som kommer in i skiktet skiktets porositet och ökar elueringshastigheten. Om styrkan hos eluenten och vattnet är jämförbar, så tränger eluenten undan vatten från skiktet [18] .

Sorptionsisoterm

Varje kromatografisk process baseras på omfördelningen av ett ämne mellan den mobila och stationära fasen. Denna jämvikt är relaterad till temperaturen, och när den stiger ökar vanligtvis andelen av ämnet i den mobila fasen. För en numerisk beskrivning av jämvikten introduceras omfördelningskoefficienter:

där C s och C m  är koncentrationerna av ämnet i den sorberande respektive den icke-sorberande fasen. Omfördelningskoefficienten bestämmer lutningen av sorptionsisotermen  - en linjär graf över förhållandet mellan C s och C m vid en konstant temperatur. Av intresse är fallet med en krökt sorptionsisoterm: i detta fall beror kurvans lutning på koncentrationen och fläckarna på kromatogrammet är suddiga. För en konkav sorptionsisoterm (där K minskar med ökande substanskoncentration) bildas en "svans" nära fläcken. Med en konvex sorptionsisoterm observeras den motsatta situationen: den främre delen av fläcken är suddig [19] . Sådana effekter förklaras av kinetiska processer (den så kallade resistensen mot massöverföring) eller den icke-linjära naturen hos sorptionsisotermen ("överbelastning"). I komplexa blandningar kan komponenter påverka varandra och skapa ömsesidiga överbelastningsförhållanden. I detta fall minskar K [19] . Som regel, i analytiska tillämpningar, är olinjäriteten hos sorptionsisotermer oönskad, eftersom den leder till utsmetning av zoner och förändringar i fläckrörlighet. Uträtning av isotermer kan uppnås genom att deaktivera sorbenten (till exempel genom att tillsätta vatten eller genom att öka lösningsmedlets elueringsstyrka). I detta fall är de mest aktiva sorptionscentra upptagna av deaktiverande tillsatser, och det sorberande skiktet blir mer homogent [19] .

Positionen för zonerna på plattan

Den vanliga och enklaste parametern som beskriver positionen för en materiazon på en platta är retentionsfaktorn:

där z x  är avståndet som zonen tillryggalagt, och z f  – z 0  är avståndet från startlinjen till lösningsmedelsfronten. Denna parameter är lätt att mäta, men den innehåller inte information om villkoren för den kromatografiska processen. Av denna anledning har andra definitioner av denna parameter Rf ' föreslagits som den relativa uppehållstiden för ett ämne i den mobila fasen eller andelen sorbatmolekyler i den mobila fasen, etc. [ 20] Det beräknade värdet av retentionsfaktorn är alltid fhR mindre än enhet, därför uttrycks parametern [21] :

Som regel mäts den sträcka som ämnet tillryggalägger från startpunkten till mitten av ämneszonen. Denna metod är lämplig för små ytor, men i farmaceutiska renhetsanalyser, där belastningen av en substans når 1000 µg per punkt, vidgas fläckarna ofta så att hR f -värdet fluktuerar i området 18 enheter. Dessutom, om ett prov med en mycket lägre koncentration elueras nära en sådan punkt, är det osannolikt att mitten av den resulterande lilla punkten sammanfaller exakt med mitten av den breddade zonen. Därför ges värdet på hR f ibland som ett intervall som täcker värden från botten av zonen till dess topp [21] . En fundamentalt annorlunda parameter är värdet på Rst , beräknat som kvoten för att dividera vägen som färdas av ämnet med vägen som färdats av någon referenssubstans. För närvarande har denna parameter praktiskt taget förlorat sitt värde [21] .

Dela alternativ

För att tydligt beskriva graden av separation av två ämnen, introducerar tunnskiktskromatografi upplösningsparametern Rs , definierad som kvoten av avståndet mellan mitten av två fläckar z x2  - z x1 dividerat med bredden på den kromatografiska toppen:

Det kan ses av ekvationen att ju högre avståndet är mellan fläckarnas centra, desto bättre är separationen, och ju bredare fläckarna är (respektive ju större parametern σ är standardavvikelsen ), desto sämre separeras ämnena. Vid R s = 0,5 är avståndet mellan fläckarna σ 1 + σ 2 ≈ 2σ, det vill säga i det här fallet inträffar "separation med 2σ" och 20% av arean av de två zonerna överlappar. När delas med 4σ är endast 3% av området täckt [22] .

Applikation

Det finns tre huvudsakliga tillämpningsområden för tunnskiktskromatografi [23] .

  1. Demonstration av grundläggande kromatografi, snabba preliminära experiment för att optimera preparativa kromatografiska separationer.
  2. Forskningsverktyg inom akademisk och tillämpad industrivetenskap, som används för att studera ett stort antal prover; kombination av plan separation med biologisk, spektroskopisk och masspektrometrisk detektion (ersätter metoden för kolonnkromatografi).
  3. Identifiering av medicin- och livsmedelsväxtkomponenter genom validerade metoder med ökade krav på noggrannhet, reproducerbarhet och känslighet.

Anteckningar

  1. ↑ Schoenbein C. F. Verhl. Naturforsh. Ges. Basel, 3, 249 (1861)
  2. ↑ Kirchner, vol. 1, 1981 , sid. femton.
  3. ↑ 1 2 3 4 Kirchner, vol 1, 1981 , sid. 17-20.
  4. ↑ Kirchner, vol. 1, 1981 , sid. tjugo.
  5. ↑ Hahn-Deinstrop, 2007 , sid. ett.
  6. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ullmann, 2012 , sid. 2-5.
  7. ↑ Geiss, volym 1, 1988 , sid. 375-377.
  8. ↑ Hahn-Deinstrop, 2007 , sid. 19.
  9. ↑ Se avsnitt Eluering
  10. ↑ 1 2 3 4 5 Ullmann, 2012 , sid. 5-7.
  11. ↑ 1 2 3 4 5 Ullmann, 2012 , sid. 7-9.
  12. ↑ Hahn-Deinstrop, 2007 , sid. 41-49.
  13. ↑ 1 2 3 4 Ullmann, 2012 , sid. 9-12.
  14. ↑ 1 2 3 Ullmann, 2012 , sid. 12-14.
  15. ↑ Ullmann, 2012 , sid. 14-16.
  16. ↑ Geiss, volym 1, 1988 , sid. 39-42.
  17. ↑ Geiss, volym 1, 1988 , sid. 45-52.
  18. ↑ Geiss, volym 1, 1988 , sid. 61.
  19. ↑ 1 2 3 Geiss, volym 1, 1988 , sid. 146-151.
  20. ↑ Geiss, volym 1, 1988 , sid. 152-153.
  21. ↑ 1 2 3 Hahn-Deinstrop, 2007 , sid. 4-6.
  22. ↑ Geiss, volym 1, 1988 , sid. 203-205.
  23. ↑ Ullmann, 2012 , sid. 2.

Litteratur

Böcker

Recensioner