Triplex-DNA , H-DNA eller triplex-DNA är en form av DNA där tre oligonukleotider lindas runt varandra för att bilda en trippelhelix. I trippelsträngat DNA binder den tredje DNA-strängen till den dubbelsträngade B-formen av DNA som bildas av Watson-Crick- interaktioner, Hoogsteen- interaktioner eller omvända Hoogsteen- vätebindningar . Tri-strängat DNA kan störa normal replikation och öka frekvensen av mutationer i bildningsregionen.
Triplexbildande oligonukleotider (TFO) är 15–25 nukleotider långa oligonukleotider som binder till huvudspåret i dubbelsträngat DNA för att bilda intermolekylärt triplex-DNA. TFO:er kan undertrycka transkription genom att binda till DNA-dubbelhelixen, eftersom bindningsställena för transkriptionsfaktorer i detta fall är otillgängliga. Införandet av TFO i en cell kan användas för att kontrollera genuttryck, platsriktad mutagenes och kan i framtiden bli en av genterapistrategierna .
Tymin (T) kan interagera med Watson - Crick- paret T - A via en Hoogsteen-vätebindning. Tymin bildar vätebindningar med adenin i det ursprungliga T—A-paret för att bilda en T—A*T-triplett [1] . I en sur miljö kan protonerat cytosin (C+) också interagera med C - G -paret via Hoogsteen-interaktioner och bilda C-G*C+-tripletten. T-A*T- och C-G*C+-tripletterna är de mest stabila möjliga tripletterna, medan T-A*G- och C-G*G-tripletterna är minst stabila [2] .
Det finns två klasser av trippelsträngat DNA: intramolekylärt och intermolekylärt. I fallet med intermolekylärt triplex-DNA bildas en bindning mellan DNA-duplexet och en annan extern DNA-sträng, som antingen kan vara från en homolog kromosom eller vara en triplexbildande oligonukleotid (TFO ) . Intramolekylärt tresträngat DNA bildas från en duplex med homopurin- och homopyrimidinregioner med upprepad spegelsymmetri [3] . Mängden intramolekylärt tresträngat DNA som bildas påverkas av graden av DNA-supercoiling [4] . Det finns två typer av intramolekylärt triplex-DNA: H-DNA och H*-DNA. H-DNA bildas i en sur miljö i närvaro av tvåvärda katjoner såsom Mg2 + . I denna konformation vänds homopyrimidinkedjan i duplexet tillbaka för att binda parallellt med purinkedjan. Denna konformation stabiliseras av bastriaderna T—A*T och C—G*A+. När det gäller den sista triaden måste cytosin protoneras, varför en sur miljö är nödvändig för bildandet av H-DNA [5] . H*-DNA bildas vid neutrala pH-värden i närvaro av tvåvärda katjoner. I fallet med H*-DNA binder homopyrimidin- och purinkedjorna till varandra på ett antiparallellt sätt. H*-DNA stabiliseras av triaderna T—A*A och C—G*G [3] [5] .
Triplexbildande oligonukleotider (TFO) är 15–25 nukleotider långa oligonukleotider som binder till huvudspåret i dubbelsträngat DNA för att bilda intermolekylärt triplex-DNA. Ett antal bevis har erhållits för att in vivo dessa oligonukleotider kan delta i regleringen av genuttryck [ 6] .
TFO:er tenderar att binda till homopurin- eller homopyrimidinställen, som oftast finns i regionen för promotorer och introner i gener [7] . TFO:er kan undertrycka transkription genom att binda till DNA-dubbelhelixen, eftersom bindningsställena för transkriptionsfaktorer i detta fall är otillgängliga. Införandet av TFO i en cell genom transfektion eller andra metoder kan användas för att kontrollera genuttryck [8] , platsriktad mutagenes och kan i framtiden bli en av genterapistrategierna . Till exempel, 2004, skapades TFO, som specifikt binder promotorn av genen som kodar för transkriptionsfaktorn ETS2 , vars överuttryck ofta observeras vid prostatacancer [9] . TFO har utvecklats som specifikt interagerar med promotorn för bcl-2- genen, som kodar för ett apoptosrepressorprotein [10] .
Undertryckande av transkription som ett resultat av bildandet av tresträngat DNA kan ligga bakom mänskliga sjukdomar och patologiska tillstånd. Således, i Friedreichs ataxi , blockerar bildandet av H-DNA uttrycket av intron 1 av FXN -genen [11] . I slutändan leder detta till lanseringen av neurodegenerativa processer i nervsystemet och rörelsestörningar i extremiteterna [12] . Bildandet av triplex-DNA kan kännas igen av reparationssystemet för nukleotidexcision , som reparerar den dubbelsträngade DNA-strukturen [13] .
Syntetiska peptidonukleinsyror (PNA) kan också interagera med duplex-DNA , där sockerfosfatryggraden ersätts av en pseudopeptidryggrad . När peptidonukleinsyra binder till duplex-DNA, förskjuts en av DNA-strängarna och en P-loop bildas. Peptidonukleinsyror är resistenta mot proteaser och kan användas för att utlösa reparation vid målstället på grund av H-DNA-bildning. PNA kan binda till den komplementära DNA-strängen med hög affinitet och specificitet via Watson-Crick-interaktioner. Under bildandet av triplex-DNA interagerar PNA med duplexet genom Hoogsteen-interaktioner [14] . Till skillnad från äkta triplex-DNA är hybriden av PNA och dubbelsträngat DNA stabil, eftersom PNA inte innehåller en negativt laddad sockerfosfatryggrad, utan en neutral pseudopeptidryggrad [15] . Till skillnad från TFO: er, som binder till duplex-DNA i regionen av huvudspåret, interagerar PNA:er med DNA-dubbelhelixen på olika sätt [14] .
En duplex DNA-sekvens av blandad sammansättning kan kännas igen av ett par pseudokomplementära PNA:er som kan dubbelinvadera DNA-spiralen på grund av den samtidiga bildningen av diaminopurin (D) och tiouracil ( U S ), vilket ersätta adenin respektive tymin [16] . Pseudo-komplementära PNAs bildar helixar av PNA:DNA-sammansättningen med var och en av duplexsträngarna på grund av bildandet av D–T, U S –A, G–C och C–G-par. En annan form av duplexinvasion kan utföras av homopurin PNA på grund av komplementär interaktion med den antiparallella DNA-strängen [17] [15] .
Slutligen kan PNA bilda en "klämma" på målplatsen som ett resultat av kemisk modifiering. En typ av "klämma" inkluderar en struktur av två PNA förbundna med en flexibel länk - 8-amino-3,6-dioxaoktansyra [18] . Denna struktur bildar en PNA:DNA:PNA-triplex vid målplatsen, där en av PNA:erna interagerar med den antiparallella DNA-strängen med hjälp av Watson-Crick-par, medan den andra strängen bildar Hoogsteen-par med den andra strängen, den andra strängen måste nödvändigtvis innehålla ett homopurin- eller homopyrimidinställe med vilket PNA interagerar [17] . En annan form av "klämma" är känd som en " svansklämma " . Den består av en PNA:DNA:PNA-klämma och ytterligare en DNA:PNA-duplex som bildar en 5–10 bp svans . I detta fall finns det inget behov av ett homopurin- eller homopyrimidinställe i den ursprungliga DNA-duplexen [15] .
Bildandet av en sådan instabil struktur som H-DNA kan orsaka genomisk instabilitet på platsen för dess utseende [19] . Till exempel, bredvid P1-promotorn för c-MYC-genen , finns polypurinregioner som kan bilda triplex-DNA, och dess bildning leder till en ökning av instabiliteten nära c-MYC . Experiment på transgena möss visade att införandet av mänskliga sekvenser som är benägna att övergå till triplextillståndet, tillsammans med sekvenser som kan passera in i Z-DNA , till regioner av genomet för vilka fall av genetisk instabilitet inte har varit kända, leder till till uppkomsten av instabilitet i dem [20] . Dessutom är det känt att bildningen av H-DNA kan främja translokationer mellan kromosomerna 14 och 18 , som ligger bakom många cancerformer , såsom follikulärt lymfom . Forskare har visat att en minskning av sannolikheten för H-DNA-bildning också minskar sannolikheten för translokationer [20] [21] .
Tresträngat DNA kan störa normal replikation och, liksom andra icke-kanoniska DNA-strukturer, öka frekvensen av mutationer i bildningsregionen [22] . Som noterats ovan kan H-DNA utgöra en fysisk barriär för transkription. Som experiment med T7 RNA-polymeras visade kunde transkriptionsapparaten inte övervinna Watson-Crick- och Hoogsteen-interaktionerna som binder triplexkedjorna, vilket ledde till transkriptionsstopp [23] . Transkriptionsstopp vid kollision av transkriptionsmaskineri med H-DNA aktiverar transkriptionskopplad reparation, på grund av vilken H-DNA skärs ut, vilket leder till deletioner [24] .
Tresträngat DNA kan kännas igen av olika nukleaser . Till exempel skär nukleaserna ERCC1-XPF och ERCC1-XPG, involverade i nukleotidexcisionsreparation, H-DNA i regionen av slingan som bildas av strängar som interagerar via Hoogsteen-par och 5'-änden av strängen som bildar Watson -Crick-par [25] . Denna lucka kan leda till stora deletioner som leder till genomisk instabilitet. FEN1 nukleas , tvärtom, förhindrar genomisk instabilitet. Den, liksom ERCC1-XPG, introducerar ett brott i H-DNA i 5'-änden av kedjan, som inte är involverad i Hoogsteen-interaktioner. I HeLa-celler som saknar FEN1 är antalet deletioner nära H-DNA större än i celler med FEN1, och den mutagena effekten av H-DNA i celler som saknar FEN1 var mest uttalad under DNA-replikering. Således hämmar FEN1 H-DNA-inducerad mutagenes på ett replikationsberoende sätt [22] [25] .
Som nämnts ovan kan TFO vara ett genterapiverktyg. Den största svårigheten i den medicinska tillämpningen av TFO och peptidonukleinsyror är deras leverans till celler [26] . År 2013, som en del av en studie som syftade till att förändra genuttrycket i hematopoetiska celler , föreslogs det att tvärbinda peptidonukleinsyramolekyler med cellpenetrerande peptider (CPPs , såväl som nanopartiklar från poly ( mjölk-ko-glycinsyra) [27] . Med hjälp av detta tillvägagångssätt lyckades författarna av arbetet modifiera 6 baspar i CCR5 -genen , mutationer i vilka är associerade med HIV- resistens [28] . CCP:er tillåter små "laster" som små biomolekyler att fritt levereras inuti celler . Poly(mjölk-samglykosyra) är en biologiskt nedbrytbar polymer som kan kapsla in peptidonukleinsyramolekyler i partiklar. Leveransen av peptidonukleinsyror i kompositionen av nanopartiklar till målceller användes i en annan studie om behandling av cystisk fibros . Peptidonukleinsyror, tillsammans med en DNA- donatormolekyl , förpackades i nanopartiklar och levererades till bronkiala epitelceller för att redigera mutationen i CFTR -genen [29] .
På 1950-talet, när den exakta strukturen av DNA var okänd, ansågs den tresträngade helixen vara en av de möjliga modellerna för organisationen av DNA i cellen. Den tresträngade strukturen av DNA ansågs vara den mest sannolika av Linus Pauling och Robert Corey [ som presenterade den tresträngade DNA-modellen 1953 [ 30] [31] . Watson och Crick, som senare fick Nobelpriset i kemi för att bestämma strukturen av DNA, lutade sig också till en början mot tresträngsmodellen, men de såg ett antal problem i den som inte stämde överens med de experimentella data som fanns tillgängliga vid den tiden . I synnerhet negativt laddade fosfater som är vända mot helixens axel skulle stöta bort varandra av elektrostatiska skäl, vilket gör det omöjligt för en stabil trippelspiral att existera. I Pauling och Koreys tresträngsmodell var vissa van der Waals-avstånd för små. R. Fraser föreslog också sin modell av en trippelhelix, där fosfater var belägna på ytan av helixen, och kvävebaser vändes inåt, men det stöddes inte av experimentella data [32] .
En alternativ tresträngad DNA-struktur föreslogs 1957 [33] . J. Fensenfeld, D. R. Davis och A. Rich förutspådde att stabilt tresträngat DNA kunde bildas om en sträng endast bestod av purinukleotider och de andra två bestod av endast pyrimidiner [6] [33] . Man trodde att en sådan struktur in vivo endast bildas som en mellanprodukt av verkan av RecA -proteinet under loppet av rekombination i bakterien Escherichia coli . Tresträngade DNA-modeller som föreslogs på 1960-talet förutspådde bildandet av inte Watson-Crick, utan Hoogsteen-par i DNA-huvudspåret [6] . En tid senare föreslogs en tresträngad DNA-modell, bestående av en pyrimidin- och två purinkedjor [6] . Upptäckten av trippelsträngat DNA i levande celler i slutet av 1980-talet som en del av supercoiled plasmider visade att bildningen av H-DNA i princip är möjlig i levande celler [34] . Dessutom visades det snart att homopyrimidin och vissa purinrika oligonukleotider kan binda till specifika sekvenser i duplex-DNA, vilket leder till bildandet av trippelsträngat DNA [35] .