Helicase-dependent amplification ( engelska Helicase-dependent amplificatio, HDA ), även Helicase-dependent isoterm amplification , är en in vitro DNA- amplifieringsmetod (liknande polymeraskedjereaktion ), som utförs vid konstant temperatur.
Polymeraskedjereaktionen är den mest använda in vitro DNA-amplifieringstekniken för molekylärbiologi och biomedicinsk forskning [1] . Denna process involverar separering av dubbelsträngat DNA vid hög temperatur till enkelsträngat ( denatureringssteg , vanligtvis uppnått vid 95-97 °C), hybridisering av primers till enkelsträngat DNA (annealingssteg) och kopiering av enkelsträngat DNA för att skapa nytt dubbelsträngat DNA (förlängningssteg, vilket kräver DNA-polymeras), vilket kräver att reaktionen utförs i en termisk cykler . Dessa bänkmaskiner är stora, dyra och kräver höga drifts- och underhållskostnader, vilket begränsar den potentiella tillämpningen av DNA-amplifiering i situationer utanför laboratoriet (t.ex. identifiering av potentiellt farliga mikroorganismer på platsen för en utredning eller patientvård). Även om PCR vanligtvis förknippas med termisk cykling, har den ursprungliga Mullis et al. avslöjat är användningen av helikas som ett medel för att denaturera dubbelsträngat DNA, vilket inkluderar isotermisk amplifiering av nukleinsyror . Under naturliga förhållanden replikeras DNA av DNA-polymeraser med olika tillbehörsproteiner, inklusive DNA-helikaser, som verkar för att separera DNA genom att linda upp DNA-dubbelhelixen [2] . HDA utvecklades utifrån detta koncept, med hjälp av helikas (ett enzym) för att denaturera DNA.
Strängar av dubbelsträngat DNA separeras först av DNA-helikas och beläggs med enkelsträngat DNA (ssDNA)-bindande proteiner. I det andra steget hybridiseras två sekvensspecifika primrar till varje kant av DNA-mallen. DNA-polymeraserna används sedan för att förlänga primrarna som hybridiserats på mallarna för att producera dubbelsträngat DNA, och de två nysyntetiserade DNA-produkterna används sedan som substrat av DNA-helikaserna för att gå in i nästa omgång av reaktionen. Således utvecklas en samtidig kedjereaktion som leder till exponentiell amplifiering av den valda målsekvensen (se Vincent et al. , 2004 [3] för ett schema ).
Sedan publiceringen av upptäckten har HDA-teknik använts för "ett enkelt, mycket anpassningsbart nukleinsyratest för att upptäcka Clostridium difficile" [4] . Andra tillämpningar inkluderar snabb detektering av Staphylococcus aureus genom amplifiering och detektion av en kort DNA-sekvens specifik för denna bakterie. Fördelen med HDA är att den tillhandahåller en snabb metod för att amplifiera en specifik målnukleinsyra vid isotermisk temperatur utan att behöva använda en termisk cykler. Men forskaren kräver tidigare optimering av primrar och ibland buffertar. Normalt verifieras och uppnås optimering av primrar och buffertar med PCR, vilket väcker frågan om behovet av extra kostnader för ett separat system för själva amplifieringen. Även om HDA inte kräver användning av en termisk cykler och därför tillåter fältforskning, görs det mesta av arbetet som krävs för att identifiera potentiellt skadliga mikroorganismer i forsknings-/sjukhuslaboratorier. För närvarande kan massdiagnostik på ett stort antal prover ännu inte uppnås med HDA, medan PCR-reaktioner utförda i en termisk cykler som rymmer provplattor med flera brunnar tillåter amplifiering och detektion av mål-DNA-målet från upp till 96 prover. HDA-reagenser är också relativt dyrare än PCR-reagenser, särskilt eftersom de kommer som ett kit.