Immuno-PCR [1] ( eng. immuno-PCR ) är en superkänslig metod för att detektera antigener baserat på deras specifika interaktion med antikroppar och detektering av denna interaktion med hjälp av polymeraskedjereaktion (PCR). På många sätt liknar immuno-PCR-metoden enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA), men istället för ett enzym för att detektera antigen-antikroppskomplexet använder den ett DNA-fragment , vars mängd ökar exponentiellt under PCR. Det är amplifieringen av detta DNA-fragment i reaktionsblandningen som är den analytiska signalen för metoden [2] .
Immuno-PCR-metoden föreslogs 1992. Sedan använde forskare från University of California det för att detektera bovint serumalbumin (BSA). I deras experiment var detektionsgränsen fem storleksordningar högre än den för standard ELISA, vid 580 molekyler per prov [2] [3] .
Immuno-PCR-metoden är en kombination av ELISA och PCR . Den första av dessa används om hormoner , antikroppar , proteiner eller toxiner behöver detekteras i klinisk diagnostik . På grund av tillgången på antikroppar med olika specificiteter tillåter denna metod detektering av ett brett spektrum av antigener . Emellertid är känsligheten för ELISA relativt låg. Å andra sidan tjänar den mycket använda PCR-metoden till att detektera mycket små mängder DNA. Teoretiskt sett räcker till och med en kopia av det detekterbara DNA:t i testprovet för att diagnostisera virus- och bakteriesjukdomar eller ärftliga sjukdomar. Tanken med immuno-PCR är att fortfarande detektera olika antigener med specifika antikroppar, men att få en positiv signal om denna upptäckt inte med hjälp av ett enzym, som i ELISA, utan med hjälp av en DNA-tagg, som i PCR [4] .
I det första steget av immuno-PCR utförs en immunokemisk reaktion mellan den analyserade föreningen i provet och antikroppen. I analogi med ELISA implementeras den på olika sätt. I den direkta versionen (fig. 1, A) appliceras ett prov innehållande antigenet som ska bestämmas på plattans yta, och sedan bestäms antigenet direkt med en specifik antikropp märkt med DNA. Om en DNA-märkt specifik antikropp inte är tillgänglig bestäms den av en sekundär (anti-art) DNA-bunden antikropp. Ett sådant format kallas indirekt (Fig. 1, B). För att bestämma antigenet i matriser ( blodserum , plasma ) används en "smörgås" (Fig. 1, C). För att göra detta immobiliseras preliminärt bindande antikroppar på ytan av tabletten, som binder antigenet när provet appliceras på brunnen. En indirekt version av smörgåsen är också möjlig (Fig. 2, D) [5] [6] .
För bestämning av lågmolekylära ämnen används ett konkurrerande format. I detta fall interagerar den detekterande märkta antikroppen inte bara med antigenet i det analyserade provet, utan också med antigenet som är immobiliserat på den fasta fasen. Ju mer antigen i provet, desto fler antigen-antikroppskomplex bildas i lösningen. Följaktligen binder mindre antikroppar till den fasta fasen och analysen ger en lägre signal [5] .
I vissa fall, istället för antikroppar, kan aptamerer användas för att detektera antigener . Till exempel binder R18 RNA-aptameren specifikt till kanin- IgG . Denna modifiering kallas immuno-aptamerisk PCR [7] .
I det andra steget, när antigenet är bundet till konjugatet av antikroppen och DNA-taggen, utförs en polymeraskedjereaktion, som ett resultat av vilken mängden DNA i blandningen ökar exponentiellt. I de första experimenten analyserades amplifieringsprodukterna med agarosgelelektrofores , men för detta var det nödvändigt att överföra reaktionsblandningarna till gelén, och resultaten var kvalitativa eller semikvantitativa. Som ett alternativ till elektrofores föreslogs realtids- PCR (RT-PCR): denna metod låter dig fastställa inte bara närvaron av en DNA-tagg, utan också dess mängd. Vid realtids-PCR tillsätts ett interkalerande färgämne (till exempel SYBR Green I ) eller en TaqMan- sond till blandningen, och mängden DNA bestäms av fluorescensintensiteten . Amplifieringssteget kan utföras antingen i samma rör som den immunkemiska reaktionen, eller så kan DNA-märkningen överföras till ett annat rör. I det andra fallet måste det först klyvas av med hjälp av restriktaser eller genom uppvärmning till 95-100 ° C. Samtidigt noteras att analysen i ett provrör är betydligt mindre känslig [7] [8] .
Teoretiskt sett är det tillräckligt att en kopia av DNA-märkningen finns i reaktionsblandningen för att få en positiv signal. Faktum är att metodens känslighet reduceras på grund av de stadier som baseras på interaktionen mellan antigenet och antikroppen. Jag tror att gränsen för detektion av immunkemiska metoder i allmänhet är cirka 1000 analytmolekyler i 100 μl av blandningen. Immuno-PCR-tekniker som beskrivs i många publikationer visar känslighet nära denna detektionsgräns och ännu lägre. Om vi antar att ett typiskt protein väger 50-100 kDa, kommer omräkning av detektionsgränsen för immuno-PCR att ge en massa i storleksordningen ett pikogram av analyten. Denna känslighet är tillräcklig för att upptäcka många biomarkörer som finns i kroppen vid låga koncentrationer [9] .
Plattformen för analys, som i fallet med ELISA eller PCR, är en mikrotiterplatta med 96 brunnar , som måste kunna binda antigener och vara värmebeständig så att PCR kan utföras direkt i den utan att överföra reaktionsblandningen till en annan tallrik. TopYield polykarbonat 8-brunnars remsor med ökad bindningskapacitet, designade specifikt för immuno-PCR, är också vanliga. (Även om det finns nackdelar förknippade med formen på deras brunnar: ojämn värmefördelning under PCR och uppkomsten av brytningszoner och reflektion av ljus, vilket gör det svårt att analysera PCR-kurvor.) Immuno-PCR utförs också i Corning Costar 6511 polykarbonatplattor och Greiner Thermoquick polykarbonatplåt 651570 , samt i Robostrips tabletter [10] .
En antikropp märkt med ett DNA-fragment är ett nyckelelement för att utföra immuno-PCR. Metodens känslighet och reproducerbarhet beror på strukturen av detta konjugat. Beroende på karaktären av förhållandet mellan antikroppen och DNA särskiljs tre huvudtyper av sådana konjugat: chimära proteiner, biotin-streptavidinkonjugat och kovalenta konjugat [11] .
Inledningsvis användes ett speciellt chimärt protein i immuno-PCR, vilket inkluderade ett protein A- fragment och ett streptavidinfragment . Ett fragment av protein A band antikroppen och streptavidin bundet DNA med en biotinmodifiering (Fig. 2a). Detta konjugat har två nackdelar. För det första är syntesen av chimära proteiner i sig tidskrävande. För det andra har protein A inte bara en affinitet för den specificerade antikroppen, utan interagerar också ospecifikt med bindande antikroppar som används när man sätter upp immuno-PCR i "sandwich"-formatet. På grund av detta visas en bakgrundssignal och metodens känslighet minskar [2] [4] .
Det visade sig i praktiken vara enklare att skapa ett konjugat baserat på interaktionen mellan biotin och streptavidin (Fig. 2, B) [12] . Det är känt att de tetramera proteinerna avidin (naturligt) och streptavidin ( genmanipulerat från kulturen av Streptomyces avidii ) bildar ett mycket stabilt komplex med biotin ( dissociationskonstant 10–13–10–15 ) . Biotin införs kemiskt i de konjugerade molekylerna - antikropp och DNA, och sedan blandas dessa molekyler med streptavidin (det är mer att föredra eftersom det, till skillnad från avidin, inte innehåller kolhydratfragment som leder till ospecifika interaktioner) för att bilda ett konjugat [2] [ 13] .
Detta tillvägagångssätt är inte helt optimalt, eftersom på grund av tetravalensen av avidin eller streptavidin kan de resulterande konjugaten ha en varierande sammansättning, vilket kommer att påverka reproducerbarheten av experimentet [14] . Senare studier av självsammansättningen av sådana komplex visade dock att streptavidin, trots sin tetravalenta natur, tenderar att fästa övervägande två biotinylerade DNA-molekyler, och konjugat med fyra DNA-molekyler bildas inte alls [15] . Den kommersiella tillgängligheten av de nödvändiga reagensen har förvandlat detta tillvägagångssätt till ett "universellt immuno-PCR-protokoll" [16] , som har blivit mycket populärt [17] .
Tack vare utvecklingen av biokonjugationsmetoder blev det möjligt att syntetisera kovalenta konjugat av antikroppar med DNA kemiskt med hjälp av bifunktionella tvärbindare (Fig. 2, C). Det finns många reagenser tillgängliga på marknaden för detta ändamål. Som regel utförs konjugering genom kemisk modifiering av aminogrupper eller tiolgrupper av DNA eller antikroppar. Tillvägagångssätt relaterade till klickkemiska reaktioner utvecklas också . Å andra sidan presenterar den vetenskapliga litteraturen otillräckliga eller motstridiga data om utbytet av sådana konjugat och metoder för deras rening [2] [18] .
Eftersom i kovalenta konjugat den detekterande antikroppen och DNA-taggen är unikt kopplade (medan de i biotin-streptavidinkonjugat är jämviktskomplex) gör detta det möjligt att bestämma flera antigener i ett prov. En av de första sådana analyserna utfördes för tre analyter med DNA-taggar av olika längd [19] . Vid bestämning av interleukin 6 jämfördes olika tillvägagångssätt och det visades att användningen av kovalenta konjugat leder till en 100-faldig ökning av känsligheten jämfört med ett stegvis protokoll [20] .
Huvudstadierna i utvecklingen av immuno-PCR: [21]
Det var möjligt att öka känsligheten för immuno-PCR genom att använda antigenets "dubbla igenkänning". Den proximala sondligeringsmetoden är baserad på användningen av två antikroppar specifika för två intilliggande epitoper av antigenet som bestäms. DNA-taggarna för dessa antikroppar skiljer sig i nukleotidsekvens men har små komplementära regioner. När båda antikropparna interagerar med ett antigen närmar sig deras DNA-märken varandra i rymden och förenas sedan under verkan av enzymet ligas . Detta skapar en ny DNA-sträng som genomgår amplifiering. Eftersom en positiv signal endast är möjlig om antigenet känns igen av två antikroppar samtidigt, gör detta schema det möjligt att utesluta ospecifik bindning [22] .
Möjligheterna för immuno-PCR utökas på grund av användningen av olika nanostrukturer i analysen. Till exempel har det föreslagits att använda magnetiska eller guld nanopartiklar som en antikroppsbärare . Deras användning gör det lättare att utföra nödvändiga manipulationer och minskar påverkan av främmande komponenter i provet. Båda nanopartiklarna används i biobarcode- analysen : de magnetiska nanopartiklarna innehåller bindande antikroppar, medan guldnanopartiklarna innehåller detekterande antikroppar och en DNA-tagg. Analysen görs i sandwichformat, varefter immunkomplexen samlas upp med en magnet och DNA klyvs från guldnanopartiklar för vidare analys. Namnet "biobarcoding" beror på det faktum att den ursprungliga publikationen föreslog en skanometrisk analysmetod. Således konjugerades det kluvna DNA:t på en glasyta, på vilken oligonukleotider som är komplementära till hälften av DNA-kedjan tidigare fixerats. Därefter tillsattes guldnanopartiklar belagda med silver(I) och innehållande oligonukleotider komplementära till den andra hälften av DNA-taggen. Sedan återställdes silvret. Om det fanns en DNA-märkning (“streckkod”) i systemet gav systemet en positiv signal. Utsikterna för denna metod är förknippade med möjligheten till samtidig bestämning av flera analyter, eftersom nanopartiklar kan "kodas" av oligonukleotider med en unik oligonukleotidsekvens [23] [24] .
En intressant utveckling av metoden är användningen av de så kallade "grodyngeln" ( eng. grodyngel ). Dessa är speciella konjugat där proteinets "huvud" är fäst vid DNA-svansen. Proteindelen av sådana konjugat innehåller en histidintagg som känner igen målantigenet, intein och en kitinbindande domän . Proteinet renades på kitininnehållande kolonner, intein skars ut i immobiliserat tillstånd och en oligonukleotid innehållande en cysteinrest fästes till den [25] [26] .
Det finns också system för immuno-PCR som använder virala partiklar, liposomer och fagdisplay [27] .
2010 föreslogs att Tus-Ter-låsbaserade konjugat skulle användas . Tus är ett protein som stoppar replikeringsprocessen; det binder tätt till korta Ter-nukleotidsekvenser. Tus-Ter-komplexet användes för stökiometrisk och platsspecifik bindning av en DNA-tagg och en antikropp [28] .
Från och med 2015 har immuno-PCR-metoden kommersialiserats: tjänster för att skapa analytiska system, inklusive de som överensstämmer med GLP- standarder , tillhandahålls av kontraktsforskningsorganisationer och bioanalytiska tjänster [29] .
Olika forskargrupper har använt immuno-PCR-metoden för att detektera viktiga proteiner och småmolekylära föreningar. Samtidigt användes många av dessa experiment för att studera möjligheterna med själva metoden, för att jämföra olika format och typer av konjugat och för att fastställa känslighetsgränserna. Data om dessa studier är systematiserade i översikter [30] [31] , och nedan är huvudresultaten på klasserna av detekterade analyter.
De vanligaste antigenerna för immuno-PCR är markörproteiner relaterade till tumörer och som finns i de tidiga stadierna av deras utveckling i mycket låga koncentrationer. De viktigaste av dem är cancer embryonalt antigen (CEA) och prostataspecifikt antigen (PSA). I en studie visade sig immuno-PCR-metoden vara cirka 1000 gånger känsligare för CEA än ELISA [32] , och senare ökades känsligheten för CEA till 13 fg/ml, vilket är 1500 gånger högre än känsligheten för klinisk metoder [33] .
PSA fungerade som en analyt för att testa tre immuno-PCR-format, av vilka det mest känsliga var formatet med ett kovalent antikropp-DNA-konjugat (detektionsgränsen var 48·10 5 molekyler) [34] . Ett system baserat på magnetiska nanopartiklar gjorde det möjligt att bestämma 0,1 pM PSA, vilket är 1000 gånger känsligare än ELISA [35] .
Immuno-PCR används för att bestämma virala proteiner, eftersom i de tidiga stadierna finns ett mycket litet antal virioner i kroppen , och de kan endast bestämmas med mycket känsliga metoder. Ett av de populära antigenerna av denna typ är hepatit B- virusmarkören HBsAg : flera gruppers arbete har reducerat detektionsgränsen för detta antigen genom immuno-PCR till 15 fg per reaktion, och fördelen i känslighet jämfört med ELISA var 2000 gånger [ 36] . Dessutom kan immuno-PCR detektera 10 ng HBcAg , ett annat protein som är associerat med närvaron av hepatit B-virus i kroppen [37] .
p24 -antigenet är en komponent i kapsiden av HIV-1- viruset och hjälper till att identifiera detta virus i ett tidigt skede. Med hjälp av immuno-PCR i olika experiment var det möjligt att detektera 1000 och 4600 molekyler av detta antigen [38] . Hantaan-virus detekteras vanligtvis med nukleokapsidproteinimmunanalysmetoder. Immuno-PCR med hjälp av fagdisplay gjorde det möjligt att detektera 10 pg/ml av detta protein, och vid användning av guldnanopartiklar ökade känsligheten till 10 fg/ml, vilket är sju storleksordningar bättre än i fallet med ELISA [39] . I analyser för H5N1 aviär influensavirus är immun-PCR också överlägsen ELISA och realtids-PCR med 1000 respektive 100 gånger [40] [41] .
Adenovirus bestäms också med hjälp av immuno-PCR , och denna metod har en fördel jämfört med PCR, eftersom det för PCR är nödvändigt att isolera DNA från provet, och i immuno-PCR-metoden sker rening från främmande komponenter i tvättstegen. Känsligheten hos immuno-PCR mot rotavirus , enligt litteraturdata, sammanfaller med känsligheten för PCR. Immuno-PCR-metoden är också användbar för detektion av norovirus [42] .
Immuno-PCR används också för att upptäcka patogener. Till exempel kan Staphylococcus aureus identifieras av dess många enzymer, proteiner och toxiner, framför allt protein A och enterotoxin typ B. Den första av dem bestämdes med immuno-PCR vid en koncentration av 1·10 −17 g/mL, och för den andra utvecklades system som gör att det kan bestämmas både i renkulturer och i livsmedelsprover [43] [44 ] . En metod har beskrivits för att detektera bakterien Borrelia burgdorferi , orsaksmedlet för borrelia , genom specifika IgG- och IgM-antikroppar mot denna bakterie [45] [46] .
Exempel på bestämning av bakterie-, växt- och mykotoxiner beskrivs också . Till exempel detekterades botulinumtoxin i avjoniserat vatten vid en koncentration av cirka 12 molekyler/ml (0,02 fg/ml). I ett annat experiment bestämdes toxoid A vid en koncentration av 90 pg/ml. Toxiner bestämdes också i mjölk (3,75 pg/ml för botulinumtoxin typ A, 750 pg/ml för botulinumtoxoid typ B, 0,1 pg/ml för Shigatoxin typ 2). Ricin har hittats i livsmedel i en koncentration av 10-100 pg/ml. Data om bestämning av aflatoxin och polyklorerade bifenyler har också publicerats [47] .
Diagnos av vissa sjukdomar och störningar är baserad på detektering inte av externa antigener, utan av komponenterna i själva organismen, såsom enzymer , lågmolekylära föreningar och joner. I vissa fall är immuno-PCR-metoden tillämpbar för dessa ändamål. Således hittades tumörnekrosfaktor vid koncentrationer upp till 1 fg/ml (50 000 gånger känsligare än ELISA). Alkaliskt fosfatas detekterades med en specifik IgG-antikropp i en mängd av 10–11 U [48] .
Vissa antigener är förknippade med utvecklingen av genetiska störningar och sjukdomar i nervsystemet. Den höga känsligheten hos immuno-PCR gör det möjligt att detektera mycket låga koncentrationer av prioner i svåra att få tag på prover av hjärnvävnad och cerebrospinalvätska . En teknik har föreslagits som gör det möjligt att samtidigt bestämma tre huvudproteiner associerade med nervsystemet genom immuno-PCR: prion, neuronspecifikt enolas och gliafibrillärt surt protein [48] .
Viktiga markörer för störningar i nervsystemet är tau-proteiner : defekta tau-proteiner ( fosforylerade vid epitoper eller isoformer av dessa proteiner) stabiliserar mikrotubuli dåligt , vilket orsakar patologier. Immuno-PCR tillåter detektering av defekta isoformer av tau-proteiner vid en koncentration av 2-10 pg/ml. Beta-amyloid , en av initiatorerna till Alzheimers sjukdom, upptäcktes vid en koncentration av 2 amol/l [48] .
Fabrys sjukdom är associerad med defekter i alfa-galaktosidas A -genen . Vanligtvis bestäms detta protein med ELISA, men immuno-PCR ger en 25-faldig ökning av känsligheten [49] .
Immuno-PCR-metoden är mycket känslig, så bakgrundssignalen spelar en avgörande roll i den, vilket kan störa observationen av ett positivt resultat. Anledningen till detta är den ospecifika bindningen av komponenterna i reaktionsblandningen eller närvaron av spår av fritt DNA i antikropp-DNA-konjugatet. Enstaka DNA förekommer även i negativa kontrollprover, och deras närvaro uppträder nästan alltid vid den 30-40:e PCR-cykeln. Optimering av immuno-PCR (val av tvättlösningar, ökning av tvätttiden, användning av nukleaser ) gör det möjligt att uppnå maximal skillnad mellan bakgrundssignalen och signalen i provrör med närvaron av antigenet som bestäms. Känsligheten hos immuno-PCR har en annan nackdel: kvaliteten på bestämningen försämras på grund av möjligheten för korskontaminering av reaktionsblandningar eller kontaminering från miljön. För att undvika detta separeras platsen för immunokemiskt arbete och platsen för PCR i rymden [50] [51] .
Immuno-PCR är en arbetsintensiv metod: analysen omfattar cirka 20 tvättsteg, och den totala analysen varar från 26 timmar till 2 dagar. Analystiden kan reduceras genom att förbereda antikropp-DNA-konjugat. Annars måste de förberedas under analysen; medan antalet stadier av inkubation och tvätt ökar [52] .